Отличия гкл и гвл: Чем отличается ГВЛ от ГКЛ: особенности материалов

Разница между ГКЛ и ГВЛ, сравнение характеристик

Сегодня отделка жилых и офисных помещений с помощью ГКЛ и ГВЛ очень распространена. Эти материалы отлично выдерживают повышенную влажность и  высокие температуры. На них удобно наносить декоративное покрытие, их легко красить и оклеивать обоями. Но существует несколько различий между этими строительными материалами, которые мы и рассмотрим. Давайте сравним характеристики и узнаем какая разница между этими товарами.

Листы гипсокартона сделаны по принципу сэндвича. Они состоят из двух основных частей: сердцевина – это гипс, наружное покрытие – плотный картон. Чтобы сердечник был прочным и не обсыпался, в его состав добавляют дополнительные укрепляющие компоненты.

Сцепляются обе составляющие гипсокартона за счет строительного клея. Картон – это своего рода армирующий каркас. Он не только прочен, но и обладает гладкой поверхностью, что позволяет его декорировать разными элементами и красить. Благодаря своим гигиеническим свойствам, ГКЛ отлично подходит для отделки жилых помещений.

Гипсокартон делят на:

Особенности применения гипсокартона

Гипсокартон незаменим в строительном моделировании. Он пластичен, отлично изгибается, что дает возможность конструировать из него арки и сложные элементы. Эти качества позволяют воплощать в реальность дизайнерские задумки, формировать из гипсокартона изогнутые поверхности стен и потолка.

Гипсоволокнистый отделочный материал

ГВЛ наравне с гипсокартоном используют для внутренней отделки жилых, офисных и производственных помещений. Отличие его состоит в строении ГВЛ-плиты. Суть в том, что она однородна.

В своем составе гипсоволокно содержит гипс (80-85%), прессованную целлюлозу (20-25%) и дополнительные примеси. Лист ГВЛ однороден, сам по себе он прочен, поэтому его не обшивают защитным слоем строительного картона.

Использование ГВЛ

Этот экологически чистый материал отлично подходит для конструирования межкомнатных перегородок, арок, подвесных потолков и сложных конструкций. Благодаря своему безвредному составу, ГВЛ можно устанавливать не только в жилых помещениях, но и в медицинских и детских учреждениях.

Конструкция ГВЛ прочная, она устойчива к ударам и другим механическим повреждениям. Выполняются листы гипсоволокна в соответствии с требованиями пожарных служб, поэтому они обладают повышенной огнестойкостью.

Гипсоволокно делят на:

Отличие ГКЛ и ГЛВ

Итак, главное отличие этих двух строительных материалов – строение каждого листа.

ГВЛ, благодаря повышенной устойчивости к ударам, отлично подойдет для конструирования перегородок. ГВЛ отлично режется, потому что при его распиле не нужно учитывать направленность картонного волокна. Поэтому если нужно смоделировать небольшие поверхности, ГВЛ будет лучшим материалом.

ГКЛ станет хорошим материалом при обшивке стен. Ведь его поверхность очень гладкая, а это значит, что покрывать его краской или оклеивать обоями будет гораздо проще. Также рекомендуется использовать ГКЛ при обшивке больших конструкций, где не требуется исполнение мелких декоративных элементов.

Сказать однозначно, что ГКЛ или ГВЛ лучше, нельзя. Каждый из этих материалов отлично справится с разными строительными задачами. Поэтому выбор должен происходить с учетом вышеперечисленных нюансов и пожеланий клиента.

Наш магазин предлагает вам:

КУПИТЬ СТРОЙМАТЕРИАЛЫ МИНСК

по низким ценам, также предлагаем вам услугу: доставка стройматериалов по Минску.

Что лучше ГВЛ или гипсокартон?

При выравнивании и отделке стен, полов и потолков в помещениях наиболее востребованными являются гипсокартонные и гипсоволокнистые листы. Их популярность обусловлена простотой монтажа, нетребовательностью к ровности поверхности под установку, возможностью нанесения любых декоративных покрытий и доступной стоимостью. Однако, что предпочтительнее: гипсоволокнистый лист или гипсокартон?

Гипсокартон имеет трёхслойную структуру, состоящую из слоя гипса, поверх которого с двух сторон наклеен картон. Представляет собой экологически чистый материал, состоящий на 93% из гипса, 6% картона и 1% специализированных добавок. Обладает малым удельным весом, поэтому не создаёт значительных нагрузок на стены.

Обратите внимание

Материал обладает оптимальным соотношением прочности и гибкости, за счёт чего при монтаже сложных поверхностей его можно изгибать без повреждений. Однако при этом он является весьма хрупким, поэтому требует использования специальных креплений при монтаже и бережной транспортировки. Механические воздействия выше определённого предела становятся причиной необратимых повреждений листов.

Среди основных свойств ГКЛ можно выделить следующие:

• простота обработки;
• отличная стойкость к воспламенению;
• листы имеют гладкую поверхность, которая пригодна для нанесения любых отделочных материалов;
• материал обеспечивает отличный воздухо- и влагообмен с внешней средой, создавая особый микроклимат в помещениях.

ТОП 3 лучших товаров по мнению покупателей

Структура и свойства гипсоволокнистых листов

Гипсоволокнистый лист, в отличие от гипсокартонного, представляет собой однородный слой, изготовленный из измельчённой целлюлозы, выполненной в виде волокон, и гипса. Для улучшения водоотталкивающих свойств производители дополнительно пропитывают верхние слои специальными пропитками.

Характерной особенностью ГВЛ является высокая прочность листов, достигаемая за счёт высокой плотности более 1200 кг/м³. Им не присуща хрупкость, поэтому их намного проще транспортировать, чем гипсокартон, а при монтаже необязательно использовать специализированные крепежи. Наблюдается разница и в пластичности — создавать арки или другие сложные поверхности не получится.

Стоит знать

Характерной особенностью ГВЛ является высокая прочность листов, достигаемая за счёт высокой плотности более 1200 кг/м³. Им не присуща хрупкость, поэтому их намного проще транспортировать, чем гипсокартон, а при монтаже необязательно использовать специализированные крепежи. Наблюдается разница и в пластичности — создавать арки или другие сложные поверхности не получится.

Среди основных свойств ГВЛ можно выделить следующие:

• способны выдерживать значительные нагрузки в среднем от 40 до 100 кг/м² при толщинах 9,5 и 12,5 мм соответственно;
• высокая огнестойкость, позволяющая монтировать листы в помещениях с повышенной температурой;
• при выполнении разреза материала кромка не раскрашивается, в отличие от ГКЛ;
• обладают достаточным уровнем звукоизоляции и минимальной теплопроводностью;
• допускается применение в качестве черновых полов.

Обзор стоимости

Сравнение и отличия ГВЛ и ГКЛ

Выбрать гипсоволокно или гипсокартон, что лучше из них, а что хуже, поможет определиться Таблица 1.

Таблица 1. Сравнение характеристик ГКЛ и ГВЛ.

Характеристика	Гипсокартон	Гипсоволокно
Плотность, кг/м3	850	1200
Теплопроводность, Вт/(м*К)	0,10-0,20	0,22-0,35
Прочность на изгиб, МПа	До 5,5	Выше 5,5
Модуль упругости	2000	2500-3000
Содержание влаги в материале, %	1	До 1,5
Уровень звукоизоляции, дБ	27-30	30-35
Соответствие классу горючести	Г1	Г1

Выбор материала для обшивки стен

Для стены выбор обшивки между гипсокартоном и гипсоволокном не так очевиден. Это связано с тем, что ГКЛ обладает меньшим весом и не создаст повышенной нагрузки на стены, но при этом будет обладать и меньшей прочностью. Поэтому их рекомендуется применять для обшивки каркасных зданий или межкомнатных перегородок.

ГВЛ листы обладают повышенной прочностью, поэтому они идеальны для обшивки промышленных объектов или помещений, где предполагаются механические нагрузки на стены, например, в спортзалах. Хотя с их помощью и не удастся сформировать сложную поверхность, зато они будут иметь минимальную хрупкость и длительный срок эксплуатации.

При обшивке стен выбор между ГВЛ или ГКЛ производится на основе двух критериев: веса конструкции и необходимости получения заданной прочности.

Подбор материала для обшивки потолков

При обшивке потолков гипсокартоном можно получить следующие преимущества:

• возможность формирования сложной конструкции подвесных потолков;
• создавать арки с радиусом изгиба листов не более 0,75 м, в зависимости от их толщины;
• возможность нанесения любых отделочных слоёв благодаря повышенной адгезии картонного слоя.

Гипсоволокнистые листы при обшивке потолков создадут примерно в два раза большую нагрузку, чем гипсокартон, а также создадутся проблемы с нанесением штукатурки, так как потребуется специально наносить слой грунтовки. Однако при этом потолок получит отличную звукоизоляцию от верхних этажей или чердака и будет обеспечена защита от влаги и пара.

Выбор материала для обшивки ванной комнаты

Для ванной комнаты конечно выгоднее использовать гипсоволокнистые панели, так как они способны стойко переносить условия повышенной влажности и смогут стойко перенести механические воздействия, например, в случае падения из-за скользких полов. Благодаря минимальному коэффициенту расширения все стыковочные швы останутся герметичными, а материал сохранит свои свойства.

Сравнение водостойких ГВЛ и ГКЛ показывает, что гипсоволокнистые листы обладают явным преимуществом, поскольку способны выдерживать высокие уровни влажности длительное время и иметь при этом минимальное уширение. В случае повреждения наружного слоя гипсокартон начинает портиться и разрушаться, а гипсоволокно сохранит свою структуру и свойства.

В ванной комнате рационально выполнить обшивку стен ГВЛ, а потолка – ГКЛ.

Результаты сравнения — что лучше выбрать?

Гипсоволокнистая панели отличается от гипсокартонной повышенной прочностью, долговечностью, звуко- и теплоизоляционными свойствами, а также огнестойкостью. Поэтому она является наиболее предпочтительным материалом для обшивки стен и потолков, при условии наличия необходимых технических условий. Однако она не позволит сформировать поверхности сложной формы.

Гипсокартон рекомендуется использовать при ограниченном бюджете проводимых работ, в целях создания конструкций со сложной геометрией, а также при недостаточных несущих способностях стен, потолков или всего объекта.

Что лучше выбрать гипсокартон или гипсоволокно для отделки дома?

При отделке и в ремонте часто используют такие популярные материалы, как гипсоволокно и гипсокартон. Это недорого и удобно. К тому же, сам процесс обработки и монтажа — не такой сложный. Не удивительно, что гипсокартонные (ГКЛ) и гипсоволкнистые листы (ГВЛ) завоевали особую любовь покупателей.

ГКЛ и ГВЛ, как правило, применяют для выравнивания стен, создания перегородок, придания стенам более привлекательных очертаний, создания арок и другого. В чём же отличие этих двух материалов и что лучше выбрать гипсокартон или гипсоволокно при строительно-отделочных работах? Ответ на эти вопросы нам поможет найти разница в составе и структуре.

Гипсокартон: свойства и виды

Гипсокартон представляет собой своеобразный слоеный пирог из листов картона, “склеенных” между собой гипсовой смесью. Данный строительный и отделочный материал отличается экологичностью, лёгкостью и гибкостью. Он также обладает хорошими теплоизоляционными свойствами.     

Чтобы улучшить характеристики листов гипсокартона, в него добавляют разные компоненты. В зависимости от этих добавок, выделяют следующие виды гипсокартона:

• ГКЛ — обыкновенные листы. Их можно отличить по серому цвету и синей маркировке.
• ГКЛВ — влагостойкие гипсокартонные листы. Они обработаны пропиткой, которая отталкивает воду, выводит влагу и защищает от грибка. Гипсокартон имеет зеленый цвет, на нем проставлена синяя маркировка.
• ГКЛО — огнеупорные гипсокартонные листы. Специальные добавки придают им улучшенную термостойкость и огнеупорность. Материал может не загораться при открытом огне до одного часа. Этот гипсокартон розового цвета с красной маркировкой.
• ГКЛВО — влагостойкий гипсокартон с повышенной огнеупорностью. Благодаря добавкам, он соединил в себе свойства двух предыдущих видов материала. Узнать эти листы можно по зелёному цвету и красной маркировке.

Отличия гипсоволокна от гипсокартона

В отличие от гипсокартона, гипсоволокно имеет не слоеную структуру. ГВЛ — это смесь волокон целлюлозы и гипса, который затем прессуется. Чтобы получилась гладкая и ровная поверхность, после прессовки материал режут и шлифуют.

Любое гипсоволокно имеет высокую огнеупорность, так как сама структура ГВЛ препятствует воспламенению.

Гипсоволокнистые листы могут быть двух видов:

• обычные ГВЛ
• влагостойкие ГВЛ.

И те, и другие, серого цвета с синей маркировкой. Вид — обычный или влагостойкий — указывается на обратной стороне изделия. Там же прописываются размеры.

Сравнение ГВЛ и ГКЛ по свойствам:

1. Гипсоволокно более плотное и прочное, чем гипсокартон. К примеру, в ГВЛ можно вбивать гвозди и вкручивать шурупы без дюбелей, чего нельзя сказать о ГКЛ. ГВЛ способно выдерживать повышенные нагрузки.
2. Гипсокартон лучше гипсоволокна по гибкости. С его помощью можно изготавливать фигурные конструкции — арки, оригинальные потолки и другие элементы отделки, которые требуют сгибания материала. С гипсоволокном проделать то же самое не возможно.
3. Гипсокартон можно резать ножом, а вот гипсоволокно придётся распиливать.
4. Для обработки углов гипсокартона нужны металлические уголки и армирующая лента. А гипсоволокно такой обработки не требует.
5. Гипсокартон нельзя покрывать краской и побелкой на кремниевой основе, а гипсоволокно это вполне допускает.
6. Гипсоволокно лучше гипсокартона по термостойкости, хотя оба материала отличаются огнеупорностью.
7. Гипсокартон намного легче гипсоволокна. Лист ГВЛ 2500Х1200 мм весит около 40 кг, а вот ГКЛ самой большой толщины — 33 кг.

Где применять ГВЛ и ГКЛ?

Для начала нужно определиться с типом помещений, которые предстоит отделывать. Если это промышленный объект — лучше сделать выбор в пользу гипсоволокна. ГВЛ может выдерживать повышенные нагрузки.

В домашних условиях можно использовать как гипсоволокно, так и гипсокартон. Обратите внимание, что гипсокартон намного легче своего более прочного собрата. Поэтому работать с ГКЛ будет значительно удобнее.

Стены

При обшивке стен в комнатах квартиры или дома вполне можно обойтись обычным гипсокартоном. Для ванной лучше использовать влагостойкий гипсокартон.

Потолок

Если Вы хотите создать оригинальную форму потолка — используйте гипсокартон. Он гораздо гибче, что позволяет дать волю фантазии. У гипсоволокна тоже есть свои преимущества. Монтировать его сложнее, зато ГВЛ обеспечит лучшую шумоизоляцию и защитит от проникновения влаги (очень актуально для ванной и кухни).  

Пол

Для отделки пола обычно используют гипсоволокно. Его прочность и устойчивость к повреждениям очевидно выигрывают в сравнении с гипсокартоном.  

Экологичность и безопасность

Стоит отметить, что оба материала экологичны. Они не содержат токсичных компонентов. А поэтому использовать листы гипсоволокна и гипсокартона можно, не опасаясь за своё здоровье.

Какой из материалов лучше выбрать гипсокартон или гипсоволокно – решать Вам. Главное — это учесть свойства листов и условия, в которых ГВЛ или ГКЛ в дальнейшем будут использоваться.  

 

Отличия ГКЛ и ГВЛ. Основные виды профиля. Монтаж гипсокартона — Делаем ремонт — Каталог статей

Содержание:

Введение

На сегодняшний момент отделка квартир и офисов, и прочих помещений на основе так называемого «сухого» строительства с применением плит из гипсокартона очень распространена. И не для кого это уже не новшество. Вот только единственное не все знают отличий ГКЛ от ГВЛ. Так что же это такое, давайте рассмотрим.

ГКЛ (гипсокартон)

Гипсокартонные листы (ГКЛ, КНАУФ-листы) представляют собой гипсовый сердечник, все плоскости которого, кроме торцевых кромок, облицованы картоном. Для формирования сердечника применяется гипс Г-4, который обладает в качестве строительного материала исключительными физическими и техническими свойствами. Для достижения необходимых показателей плотности и прочности в него добавляются специальные компоненты. Другой важнейшей составляющей гипсокартона является облицовочный картон. Сцепление с сердечником из гипса обеспечивается за счет применения клеящих добавок. Картон играет роль армирующего каркаса и является прекрасной основой для нанесения любого отделочного материала (штукатурки, обоев, краски, керамической плитки и др.). По своим физическим и гигиеническим свойствам картон идеально подходит для жилого помещения. КНАУФ-листы применяют для внутренней облицовки стен, устройства межкомнатных перегородок, подвесных потолков.

ГКЛ подразделяются на:

• обычные (ГКЛ)
• влагостойкие (ГКЛВ)
• с повышенной сопротивляемостью воздействию открытого пламени (ГКЛО)
• влагостойкие с повышенной сопротивляемостью воздействию открытого пламени (ГКЛВО)

Особенность гипсокартона

Известно, что ГКЛ, наравне с имеющимися перечисленными характеристиками, обладает еще одной замечательной способностью — приобретение пластичности во влажном состоянии и восстановление изначального качества после высыхания, при этом сохраняя приданную ему форму. Это значительно расширяет дизайнерские и архитектурные возможности ГКЛ, как строительного материала, путем возможности формирования практически любых изогнутых поверхностей будь то потолок, или стена. При изготовлении криволинейных форм используются гипсокартонные листы шириной 600 мм. Следует учитывать тот факт, что минимальный радиус изгибания листа толщиной 12,5 мм составит примерно 1000 мм, и при уменьшении толщины ГКЛ радиус также уменьшается. Так, для листов толщиной 9 мм минимальный радиус изгибания составляет примерно 500 мм.

ГВЛ (гипсоволокнистый лист)

Гипсоволокнистые листы (ГВЛ, КНАУФ-суперлисты), используются для отделки интерьеров, особенно таких, где имеются повышенные требования к пожарной безопасности. Они изготавливаются из гипса не ниже Г-4, с распущенной целлюлозной макулатурой в качестве наполнителя. Гипсоволокнистые листы — однородный экологически чистый строительный материал, использующийся для устройства межкомнатных перегородок, подвесных потолков и внутренней облицовки стен в жилых помещениях, промышленных зданиях, помещениях объектов социальной сферы и медицинских учреждений, школах, детских садах и санаториях. Производится методом полусухого прессования. ГВЛ используется для устройства перегородок и облицовок стен с повышенными требованиями защиты от ударного воздействия, для устройства сборных оснований (сухих стяжек) пола под покрытия или при наличии повышенных требований к пожарно-техническим характеристикам применяемых конструкций.

ГВЛ подразделяются на:

• обычные (ГВЛ)
• влагостойкие (ГВЛВ) (ГВЛВ в отличие от ГВЛ обработан специальной гидрофобизирующей жидкостью, чем повышается стойкость его поверхности к повышенной влажности)
• влагостойкие малоформатные (DIY)
• КНАУФ-суперпол (ГВЛВ ЭП)

Отличия ГВЛ от ГКЛ. Что лучше выбрать?

Итак, рассмотрев ГКЛ и ГВЛ, остановимся отдельно на отличиях. Что же все-таки выбрать? ГВЛ используется для устройства перегородок и облицовок стен с повышенными требованиями защиты от ударного воздействия, то есть он тверже, чем ГКЛ. ГВЛ легче переносит распиловку в любом направлении, так как однороден по составу. ГКЛ менее прочен и режется поперек, чтобы не нарушить армирование из картона (хотя в некоторых случаях допускается рез по длине), зато способен при размачивании приобретать пластичность, а при высыхании восстанавливать изначальную прочность. Гипсокартон — это лучшая основа под обои. Их можно клеить без всякой предварительной обработки, единственное, что нужно сделать, — покрыть шляпки гвоздей нитроэмалью или спиртовым лаком во избежание коррозии. А можно не оклеивать стены, а, например, побелить или покрасить клеевой или масляной краской, как обычные оштукатуренные поверхности. Не рекомендуется только использовать известковые краски, так как они плохо сцепляются с картоном. Ответить однозначно, что лучше ГВЛ или ГКЛ нельзя. Универсального ответа нет. Все зависит от поставленной задачи и условий эксплуатации помещения.

Основные марки профиля для ГКЛ или ГВЛ

Металлические профили используются во всех категориях зданий: жилых, общественных, промышленных и сельскохозяйственных. Они служат для формирования каркасов различных по конструкции и назначению, в том числе для перегородок, облицовок и подвесных потолков. Каркасы, в свою очередь, являются жестким основанием для крепления гипсокартона и ГВЛ.

Основные марки профиля для крепления ГКЛ или ГВЛ:

Наименование профиля	Эскиз	Марка профиля
потолочный		ПП 60×27х0,5
потолочный направляющий		ПН 28×27х0,5
направляющий		ПН 50x40x0.5
перегородочный стоечный		ПС 50x50x0.5

Как правильно резать листы гипсокартона

При монтаже гипсокартона используйте цельные листы везде, где возможно. Отрезайте лист гипсокартона по длине так, чтобы конец листа приходился на опорные балки, перекладины, стойки или косяки. Для того, чтобы правильно отрезать лист по длине, сначала установите его так, чтобы конец его выступал за край, до которого вы планируете положить гипсокартонное покрытие. Измерьте необходимую длину при помощи рулетки. Затем воспользуйтесь специальным инструментом для гипсокартона — рейсшиной и пометьте ножом на листе гипсокартона место начала и конца разреза. Проведите специальным ножом надрез по длине листа гипсокартона. Чтобы получить максимально ровную линию во время первого надреза можно также приложить к гипсокартону импровизированную линейку. В этих целях можно использовать широкий металлический профиль, уровень и т.п. Хлопните по одной из сторон листа. Гипсокартон должен сломаться ровно по месту сделанного вами надреза. Если торцевая кромка, получившаяся в результате резки, не достаточно ровная то ее следует поправить специальной теркой. Нельзя допускать отслаивания бумаги от гипса т.к. это может негативно сказаться на качестве. Если на торце образовалась бумажная «бахрома» — ее следует срезать ножом. Также для отреза можно воспользоваться дисковым резаком по гипсокартону. При этом не разорвется бумага, покрывающая сердечник гипсокартона снизу. Поэтому для того, чтобы полностью отделить куски листа, проведите лезвием ножа по месту разреза, чтобы разделить и заднее покрытие. Иная технология монтажа гипсокартона применяется, когда вам нужно разрезать лист гипсокартона в местах, где есть внутренние углы. Для выполнения подобных разрезов воспользуйтесь специальным инструментом — ножом для гипсокартона. Сделайте надрез в том месте, где нужно разрезать лист и резко отогните один край назад, как было описано выше. После этого вам опять придется разрезать бумагу, покрывающую сердечник гипсокартона с обратной стороны. Другой способ выполнить разрез для внутреннего угла – сначала закрепить лист гипсокартона в том месте, где вы делаете перекрытие, и затем ножом — инструментом для гипсокартона, сделать нужное отверстие.

Вырезание фигурных деталей из гипсокартона

Чтобы получить деталь с неровными краями (дуга, волна, зигзаг и т.п.) для работы с гипсокартоном можно использовать специальную пилку, но при ее использовании лист может крошиться и край детали получится неровным. Если пытаться выровнять край, то могут измениться размеры детали. В таких случаях гораздо проще и удобнее для работы с гипсокартоном использовать электролобзик.

Сверление гипсокартона

Часто для монтажа встраиваемых осветительных приборов и т.п. требуются отверстия в гипсокартоне. Небольшие отверстия сверлятся обычными сверлами, а более крупные (для галогеновых ламп, различных труб и т.п.) – специальными пилками для работ по гипсокартону или высверливаются коронками.

Изгибание гипсокартона

Для создания арок, фигурных потолков и некоторых других конструкций необходимо получить изогнутые детали. Существует несколько способов работы с гипсокартоном для изгиба детали.

Первый способ. Намочить деталь и, когда она станет гибкой, придать ей необходимую форму. После высыхания деталь можно монтировать. Такой способ работы с гипсокартоном конечно дает возможность получить изогнутую деталь, но потребует значительных затрат времени что не очень порадует заказчиков.

Второй способ. Использовать специальный валик с шипами (игольчатый валик). С его помощью прокалывается бумага с внешней стороны предполагаемого изгиба гипсокартона, и затем деталь изгибается путем приложения физической силы. В результате бумага благодаря проколам надрывается и дает возможность изогнуть деталь. Способ вполне эффективный, однако потребует специальных навыков, а деталь может быть проблематично прикрутить, и до шпатлевки она будет выглядеть совсем неэстетично.

Третий способ работы с гипсокартоном для изгиба детали заключается в надрезании внешней стороны предполагаемого изгиба с интервалом примерно 5 см. В зависимости от крутизны изгиба интервал может меняться. Затем деталь надламывается в местах надрезов, и изгибается в нужной степени. Подготовленная таким образом деталь легко монтируется, и на ее изготовление потребуется минимальное количество времени.

Монтаж гипсокартона

Прежде всего следует отметить, что в мире существует множество систем и способов монтажа гипсокартона. Рассмотрим наиболее популярные из них:

Первый способ. Монтаж осуществляется с помощью так называемых клеевых составов. Это, можно сказать, самый простой способ монтажа: на предварительно подготовленную (очищенную от старых обоев, штукатурки, и т.д. и прогрунтованную должным образом) поверхность стены (монтаж потолков из гипсокартона таким способом по естественным причинам не осуществляется) наносится клеевой состав, приготовленный в соответствии с инструкцией производителя. Наносить клей следует «лепешками» на расстоянии не более 35см друг от друга, исключение составляют углы комнаты, и места стыков листов, где клей наносится сплошным слоем. Также при нанесении клея следует учитывать индивидуальные наклон, искривление, деформацию стены, т.е. в местах выпуклых следует наносить меньше клея, и наоборот. В местах, где впадины слишком велики, следует предварительно наклеить полоску гипсокартона, как бы выравнивая поверхность. Проверить эти характеристики можно при помощи уровня, и натянутой вдоль стены нити. После нанесения клеевого состава к стене прижимается вырезанный заранее лист гипсокартона. Далее при помощи уровня и умелых рук лист выставляется в необходимую нам плоскость. Иногда при монтаже гипсокартона на клеевой состав сначала на стену наклеиваются полосы гипсокартона (так называемые «маяки») шириной около 15см, а уже непосредственно на них клеится сам лист. При этом не следует забывать дать клею высохнуть. Достоинствами этого способа являются простота, высокая скорость монтажа и отсутствие необходимости в специальном наборе инструмента. К недостаткам можно отнести невозможность создания новых перегородок и ниш: кроме того, этот способ не позволяет укладывать листы на деревянную основу.

Второй способ. Монтаж гипсокартона производится на каркас из деревянных брусков. Монтаж гипсокартона на каркас из брусков был популярен около десяти лет назад, в связи с существовавшим в то время дефицитом на металлопрофиль. Данный способ состоит из двух этапов: сборка каркаса из брусков и собственно монтажа листов гипсокартона на деревянный каркас. Сборка каркаса из брусков начинается с выставления и последующей фиксации направляющих. В зависимости от материала, к которому крепится брус, подбирается соответствующее крепление, чаще всего это дюбельгвоздь (если основание бетонное, кирпичное и т.д.) или саморез с крупным шагом (если основание деревянное). Для выставления направляющих, как и всего каркаса, используется уровень и полоски шпона, которые при необходимости подкладываются под бруски. После установки направляющих выставляются и фиксируются основные бруски. Они должны устанавливаться не более чем в шестидесяти сантиметрах друг от друга, т.е. так, чтобы каждый лист гипсокартона крепился как минимум по краям и в центре, а края соседних листов крепились к одному бруску. Перед монтажом предварительно вырезанных листов гипсокартона следует убедиться в том, что собранный каркас образует одну плоскость, и, при наличии недостатков, устранить их. Гипсокартон крепится к деревянному каркасу при помощи саморезов по дереву. При этом расстояние между саморезами не должно превышать тридцати сантиметров, а сами саморезы должны вкручиваться в гипсокартон таким образом, чтобы их шляпки оказались слегка утопленными, но не допуская разрывов бумаги. По сравнению с предыдущей методикой монтажа гипсокартона данный способ обладает рядом существенных преимуществ. К таковым, в первую очередь, относят возможность создания новых конструкций, таких как арки, перегородки, ниши, и т.д.; кроме того, мы получаем возможность изменять формы существующих стен и перегородок. Однако это более трудоемкий и требующий наличия специального инструмента способ. Не следует также забывать, что при перепадах температуры и влажности древесина имеет свойство деформироваться, что не может не отразиться на качестве всей конструкции.

Третий способ. Монтаж гипсокартона с использованием металлокаркаса. Для создания каркаса используется металлопрофиль. Сборка металлокаркаса, как и в предыдущем случае, начинается с выставления и последующей фиксации направляющих. Для выставления направляющих, как и всего каркаса, используется уровень. Отличие заключается в том, что крепление основного профиля осуществляется посредством специальной фурнитуры, именуемой «подвес», и саморезов по металлу. Использование подвесов позволяет одновременно прикрепить металлопрофиль к стене и выставить его в нужной плоскости, что значительно облегчает процесс монтажа гипсокартона. Подвесы должны располагаться на расстоянии не более семидесяти сантиметров друг от друга, а основной профиль — устанавливаться не более чем в шестидесяти сантиметрах друг от друга, т.е. так, чтобы каждый лист гипсокартона крепился как минимум по краям и в центре, а края соседних листов крепились к одному профилю. Гипсокартон крепится к металлокаркасу при помощи саморезов по металлу. При этом расстояние между саморезами не должно превышать тридцати сантиметров. Монтаж гипсокартона на металлокаркас является наиболее актуальным способом на сегодняшний день, т.к. он, сохраняя почти все преимущества других способов, не обременен их недостатками. Вдобавок ко всем плюсам при использовании металлокаркаса имеется также возможность скрыть под гипсокартоном электропроводку, радиаторы отопления, трубы и т.п., и установить встраиваемые осветительные приборы – галогеновые лампы и т.п. К минусам этого способа можно отнести необходимость в специальном инструменте и квалифицированных специалистах.

Меры безопасности

Гипсовая пыль может стать причиной раздражения глаз и дыхательных путей. Поэтому следует заранее позаботиться о защите глаз и легких. Для этого необходимо воспользоваться защитными очками и маской или респиратором, а также обеспечить правильную вентиляцию места проведения ремонта. Внимательно изучите назначение каждого инструмента и используйте эти инструменты только для тех операций, для которых они специально предназначены. Неотточенные инструменты опасны и могут стать помехой, а то и вовсе нанести вред работе. Всегда работайте острыми лезвиями. Следите за вашими инструментами для гипсокартона, держите их в безопасных местах. Всегда отключайте в помещении электричество, если работаете в потенциально пожароопасных местах. Будьте осторожны, работая на козлах, строительных лесах и лестницах. Нельзя забывать о том, что при установке строительной лестницы все ее ножки должны крепко стоять на земле. Никогда не пытайтесь тянуться куда-то в сторону или вверх, работая на лестнице. Следите за тем, чтобы дети не появлялись на строительной площадке и не подпускайте их к электроинструментам и строительным материалам, растворителям и т.д., которые могут быть опасны для их здоровья. Содержите место работы в чистоте и не допускайте скопления на строительной площадке мусора и отходов.

Обсуждение темы на форуме: ГВЛ или ГКЛ. Что лучше выбрать?

в чем разница, размеры листа, виды, что лучше

В последнее время все популярнее становятся «сухие» технологии строительства и отделки. Оно и понятно. При меньших затратах времени результат получается очень даже достойный. Вот только надо правильно подобрать материалы. Если вы хотите выровнять стены, потолок, сделать пол или обшить каркас, но не хотите использовать потенциально опасные для здоровья материалы, содержащие формальдегид, выбирать придется из листовых материалов, сделанных на основе гипса. Это гипсоволокно (ГВЛ) и гипсокартон (ГКЛ). Но вот решить что лучше использовать — ГВЛ или ГКЛ — не так то и просто. У обоих материалов есть свои плюсы и минусы. И, самое разумное, использовать оба, но на тех участках, где их свойства будут востребованы. 

Содержание статьи

ГВЛ и ГКЛ: что это в строительстве

Гипсокартон и гипсоволокно — относительно новые строительные материалы. Они появились пару десятков лет назад, но уже уверенно потеснили традиционные материалы. Чтобы понять ГВЛ или ГКЛ вам лучше использовать, надо иметь четкие представления о том, что это за материалы, в чем их достоинства и недостатки. На основании этих знаний вы сами сможете принимать оптимальные решения. Потому что нельзя однозначно сказать, что лучше — ГВЛ или ГКЛ. Где-то больше подходит один материал, где-то лучше использовать второй. Так что давайте разбираться с тем, что это за материалы и какие виды ГКЛ и ГВЛ существуют.

Выбрать между ГВЛ и ГВК не очень просто

ГКЛ: что это и какие бывают виды

ГКЛ — это аббревиатура названия ГипсоКартонный Лист. Этот материал представляет собой два картонных листа, между которыми находится слой гипса. Соединяются между собой они при помощи строительного клея. Называется часто «гипсокартон», или используется аббревиатура ГКЛ, иногда можно услышать «гипрок». Последнее название встречается зонально — более распространено в Петербурге и окрестностях. В этом регионе гипсокартон поставлялся финской фирмы Gyproc («Гипрок»), которое постепенно стало именем нарицательным.

Что такое ГКЛ и каких видов он бывает

Используется ГКЛ для «сухого» выравнивания стен или обшивки каркасов при каркасном домостроении. Пригоден для внутренних работ, для наружных слишком хрупкий. Используют гипсокартон для стен, перегородок, потолков.

При производстве ГКЛ используют плотный и гладкий картон. Он служит как армирующий и придающий форму элемент. Гипсовая прослойка придает прочность, держит форму. В большинстве случаев лист гипсокартона имеет более тонкий край по длинной стороне (есть и ровные, с прямыми углами). Это позволяет при стыковке аккуратно шпаклевать стыки. Так что под некоторые виды отделочных материалов не надо шпаклевать всю площадь.

ГКЛ могут иметь разную кромку. Выбирать ее надо в зависимости от области использования

Выпускают гипсокартон для разных условий эксплуатации, для легкого распознавания применяют картон разного цвета (серого, зеленого, розового):

• Для помещений с нормальными условиями эксплуатации —  стандартный ГКЛ. Имеет серый цвет.
• Для помещений с повышенным уровнем влажности — влагостойкий ГКЛВ. Окрашивается в зеленый цвет.
• Для пожароопасных помещений/зданий — огнестойкий — ГКЛО. Имеет розовый цвет.
• В помещениях с повышенной пожарной опасностью и высокой влажностью используют ГКЛВО — огнеупорный влагостойкий гипсокартон.
• В последнее время, стал пользоваться популярностью звукоизоляционный гипсокартон (ГКЛЗ). Он обладает повышенной плотностью гипсового сердечника и армирован стекловолокном. Предназначен для увеличения звукоизоляции каркасно-обшивных конструкций стен, потолков и перегородок. Лист имеет фиолетовый или синий цвет.

ГКЛЗ — звукоизоляционный гипсокартон. КНАУФ-лист (ГСП-DFh4IR) обладает следующими свойствами: увеличенная плотность, влагостойкость, ударостойкость, повышенная прочность

Теперь вы знаете что такое ГКЛ, какие виды гипсокартона есть и где они применяется. Это популярный материал для внутренней отделки. Он не содержит вредных веществ, хотя, некоторую опасность может представлять гипсовая пыль, которая может появиться в процессе эксплуатации. Чтобы решить, что лучше ГВЛ или ГВК, теперь поговорим о гипсоволокне.

ГВЛ — что это, из чего делают, какие есть виды

Название ГВЛ — это тоже аббревиатура от технического названия листового строительного материала: ГипсоВолокнистого Листа. Этот материал изготавливается из смеси гипса с волокнами целлюлозы (распушивают макулатуру). Масса замешивается с водой, из нее под прессом формуются листы, которые доводятся до нормальной влажности (высушиваются).

Типы кромки — на стены лучше с фаской, на пол — ровные

ГВЛ также используется для сухого выравнивания стен и потолков, обшивки каркасов, настила полов. В отличие от ГКЛ, имеет «базовую» негорючесть, так как целлюлоза покрыта слоем негорючего материала — гипса. Выпускается ГВЛ с двумя видами кромки — ровной и фальцевой. Фальцевая кромка снимается рубанком, глубина фаски около 2 мм, ширина около 30 мм. При монтаже на стены, это позволяет дополнительно укрепить шов (проложить армирующую сетку) и зашпаклевать его.

Гипсоволоконные плиты при помощи специальных добавок приобретают специальные свойства. По этому признаку существуют следующие виды:

• Стандартные — ГВЛ. Для монтажа в помещениях с нормальной влажностью.
• Влагостойкие — ГВЛВ. Используются в помещениях с повышенным уровнем влажности, для выравнивания пола без стяжки.
• Влагостойкий материал повышенной прочности для устройства пола. Маркируется ГВЛВ ЭП (влагостойкий ГВЛ Элемент Пола).

Внешне, влагостойкие листы от стандартных ничем не отличаются. Если производитель нормальный, на листе нанесена маркировка, в которой, кроме размеров листов проставлен тип — ГВЛ или ГВЛВ. Еще отличаются они по типу поверхности: ГВЛ бывают шлифованные и нешлифованные. Шлифованные («Кнауф») значительно выше по цене, но не требуют обязательной шпаклевки всей поверхности перед проведением отделочных работ.

ГВЛ и ГКЛ: свойства и сравнение

Пока особой разницы между ГВЛ И ГКЛ незаметно. И то, и другое — листовой материал, который можно использовать для обшивки стен и потолка. Только гипсоволокно подходит для устройства пола, а гипсокартон нет. Это только начало. Давайте разбираться дальше.

Можно и не выбирать: ГВЛ или ГКЛ, а использовать их вместе

Плотность, прочность

Если сравнивать ГВЛ и ГКЛ, то гипсоволокно имеет большую плотность, и, соответственно, при одинаковой толщине, большую прочность и массу. Большая прочность — оно, вроде, хорошо. Во всяком случае ГВЛ не так просто пробить ударом. Плюс еще в том, что на каркасную стену, обшитую ГВЛ, можно без опаски навесить полки.

Далеко не любой винт можно закрутить в ГВЛ без предварительного сверления отверстий

С другой стороны большая плотность — сложнее монтаж. Далеко не всякий саморез можно закрутить в гипсоволокнистую плиту без предварительно сделанных отверстий. Можно обойтись без сверления, но только если использовать винты с самонарезной головкой и мощный шуруповерт. Причем, без предварительной зенковки (сверления отверстия большего диаметра) «утопить» шляпку в гипсоволокне не получится. При обшивке ГВЛ в два слоя без предварительного сверления отверстий, может получиться так, что винт, закручиваемый во второй лист, «пытается» отжать нижний.

Гипсокартон имеет меньшую прочность, его можно пробить ударом кулака. Зато в него легко «заходят» обычные саморезы. При монтаже ГКЛ самое важное — не перетянуть и не порвать головкой шурупа картон. Иначе он проваливается в гипсовый слой, который лопается. Приходится крутить в другом месте. Если подряд так несколько раз «накосячить», придется менять лист, так как он держаться просто не будет.

Допустимые длительные нагрузки на крепеж установленный в ГКЛ

И, кстати, на стену, обшитую в один лист ГВЛ,  правильно установленный специальный дюбель (бабочка или называют еще ромашка) длительное время выдерживает массу 80 кг. Вопрос в том, что надо соблюдать технологию.

Вес ГКЛ и ГВЛ

Теперь о том, чем плоха большая плотность. Первый минус уже описали: сложнее устанавливать крепеж. Второй — большая плотность — это большая масса.  То есть для монтажа ГВЛ при тех же условиях требуется более мощный каркас. При перевозке придется учитывать тоннаж, с тяжелыми листами сложнее работать. Вес одного листа ГВЛ исчисляется десятками килограмм. Например, у гипсоволоконных плит Knauf («Кнауф») такие параметры:

• лист размерами 2500*1200*10 мм весит около 36 кг;
• ГВЛ 2500*1200*12,5 мм имеет массу 42 кг;
• элемент пола 1550*550*20 мм имеет массу около 18 кг.

Гипсокартонные листы значительно легче (см. таблицу).

Вес гипсокартона в зависимости от размеров, толщины, вида

Если говорить о массе квадратного метра гипсоволокнистого листа, ее можно рассчитать по формуле:

• Масса квадрата ГВЛ не может быть менее 1,08*S,
• но не может быть больше 1,25*S.

Где S — номинальная толщина листа в миллиметрах. Так что диапазон значений определить достаточно легко. Вместе с тем, производители по какой-то причине не указывают массу одного листа. Эти данные можно найти только у Knauf. По их информации получается примерно такая картина:

• ГВЛ толщиной 10 мм — 12 кг/м²;
• ГВЛ толщиной 12,5 мм — 14 кг/м²;
• ЭП толщиной 20 мм — 21,5 кг/м².

Если сравнить со средней массой ГКЛ, волоконные гипсовые плиты будут несколько тяжелее. А при переноске  надо думать как их не поломать. Естественно, крепить ГВЛ надо на более мощное основание.

Гибкость и хрупкость

Гипсокартон, из-за того, что гипс находится между двух слоев картона, более гибкий. Картон выполняет задачу армирования, принимая значительную часть нагрузки на себя. Особенно при изгибающих нагрузках. Например, лист ГКЛ можно поднять с одной стороны, взявшись за короткую сторону. Он прогнется, но не треснет. Если ту же операцию попытаться провести с гипсоволоконным листом, он треснет.

Их легко отличить внешне, но решить какой лучше не так то просто

Еще один плюс ГКЛ — им можно отделывать изогнутые поверхности. Есть несколько технологий, благодаря которым можно делать арки, колонны, плавно изогнутые рельефы на стенах и потолках. ГВЛ такой возможности не дает. Он очень плохо воспринимает изгибающие нагрузки как вдоль, так и поперек листа: волокна целлюлозы очень короткие и плита просто ломается. Так что если вам нужно отделывать гнутые поверхности, выбор между ГВЛ или ГКЛ сделать просто в пользу второго.

Звукоизоляция и теплопроводность

При выборе материала для обшивки, важны такие показатели, как теплопроводность и звукоизоляция. Как известно, они зависят от плотности, так как ГОСТами допускается достаточно широкая вилка в плотности ГВЛ, смотреть эти характеристики надо по каждому конкретному производителю. Чтобы можно было хотя бы примерно ориентироваться, есть такие данные:

• Теплопроводность ГВЛ плотностью от 1000 кг/м3 до 1200 кг/м3 имеет теплопроводность от 0,22 Вт/м °С до 0,36 Вт/м °С.
• Теплопроводность ГКЛ находится примерно в том же диапазоне —  от 0,21 до 0,34 Вт/(м×К).

Основные технические характеристики ГВЛ

Если говорить о звукоизоляции, наблюдается та же картина: характеристики примерно равны. ГВЛ дает лишь на 2 дБ лучшую защиту по сравнению с ГКЛ. Стоит также помнить, что при желании можно найти акустический гипсокартон. Он имеет специальные характеристики, применяется для обшивки магазинов, концертных залов, студий. Если говорить о частном домостроении его стоит использовать в спальнях.

Что тише ГКЛ или ГВЛ

Если смотреть на характеристики, разницы по звукоизоляции между ГКЛ и ГВЛ нет. Но этот параметр учитывает «проведение» звука. Тут, действительно, большой разницы нет. Вот по ощущениям она есть. И значительная. Помещение, обшитое гипсоволокнистыми плитами, намного тише. Оно не такое гулкое. Звуки от гладкого картона отражаются, а в неоднородной поверхности волоконных плит «вязнут». Так что если вам важна тишина в доме, выбирая между ГВЛ и ГКЛ останавливайте выбор на гипсоволокне.

ГВЛ или ГКЛ: что лучше?

И у того, и у другого материала есть почитатели и противники. Решать что лучше ГВЛ или ГКЛ вам придется самостоятельно. В этом разделе постараемся сравнить их по наиболее значимым параметрам. Сразу пройдемся по размерам. Гипсокартон выпускают в более широком диапазоне как по размерам листов, так и по толщине:

• Толщина листа ГКЛ: 6,5 мм, 8 мм, 10 мм, 12,5 мм, 14 мм, 16 мм, 18 мм, 24 мм. Последние три — это большая редкость.
• По высоте листа ГКЛ может быть от 2000 мм до 4000 мм с шагом в 50 мм.
• Ширина ГКЛ — 600 мм или 1200 мм.

Как видите, ассортимент более чем широкий. Другое дело, что в продаже обычно есть два-три вида. Но, при горячем желании, все можно найти/заказать. Хотя, обычно проще (и дешевле) купить то, что имеется.

Для пола лучше ГВЛ

С размерами ГВЛ повезло меньше. Имеем только два варианта плит из гипсоволокна: 2500*1200 мм (стандартный) и 1500*1000 мм (малоформатный). Оба варианта могут быть толщиной 10 мм и 12,5 мм. Всё. Других размеров по стандартам нет. Есть еще ГВЛ для пола. Его размеры 1200*600 мм, толщина 20 мм. Может быть с фаской или нет.

	ГКЛ	ГВЛ
Стоимость за квадрат	от 70 руб/кв.м.	от 180 руб/кв. м.
Ударные нагрузки	крошится	нормально переносит
Изгибающие нагрузки	нормально переносит, гнется	ломается
Раскрой	легко режется канцелярским ножом	необходим серьезный инструмент со специальным диском
Установка крепежа	легко закручиваются специальные шурупы	крутить тяжело, необходимо предварительно сверлить отверстия или использовать винты с самонарезной головкой
Изменение размеров при повышении влажности/температуры	1 мм на метр	0,3 мм на 1 метр
Огнестойкость	высокая — Г1	негорючий — НГ
Монтаж на криволинейные пверхности	возможен	нет

В итоге сказать, что лучше ГВЛ или ГКЛ, можно только конкретно по области применения и условиям эксплуатации. Если кратко, вот как можно разделить области применения:

• ГВЛ для стен и потолка лучше если требуется пожароустойчивость или надо повысить жесткость конструкции (в каркасниках).
• На пол лучше класть ГВЛ, так как он меньше реагирует на влажность, не меняет своих свойств.
• ГКЛ незаменим, если нужны плавные линии или сложные многоярусные конструкции. Многоуровневый потолок, арки, колонны, скругленные стены и углы — это только гипсокартон.
• Если надо добиться хорошей звукоизоляции второго этажа, потолок лучше подшивать ГВЛ.

Как вы понимаете, окончательно сказать что лучше ГВЛ или ГКЛ так и нет возможности. В одних условиях, для выполнения одной задачи лучше один материал, для другой больше подходят характеристики другого.

ГКЛ и ГВЛ: в чем отличия? — Гипсокартон — Статьи и видео

«Сухим» методам строительства в последнее время стали уделять все большее внимание. Во-первых, нет необходимости в сушке материала, во-вторых, работы сводятся к меньшему выполнению технологических операций и в-третьих, срок выполнения работ значительно сокращается. Гипсоволокно (ГВЛ) и гипсокартон (ГКЛ) являются самыми распространенными в строительстве материалы. Слышали о них многие, но не все знают, в чем их отличие.

Что такие ГКЛ и ГВЛ

ГКЛ — листы гипсокартона, которые имеют гипсовый сердечник, кромки которого облицованы со всех сторон картоном, за исключением торцевой части. Из этого и следует название этого материала — гипсокартон. Для придания прочности гипсокартону в гипсовую основу добавляют связующие компоненты. Благодаря клеевым добавкам картон надежно сцеплен с гипсовой основой, в последующих работах на него с легкостью наносится любой тип отделочного материала.

ГВЛ — листы гипсоволокна, которые используются в строительстве и представляют собой однородный материал. Этот материал обладает исключительной прочностью. При его производстве используется метод сухого прессования, именно он позволяет сделать ГВЛ очень прочным. Это обусловило его применение в устройстве конструкций, которые в процессе эксплуатации подвергаются ударным воздействиям. Особенно востребован этот материал при изготовлении сухих стяжек.

Сравнение ГВЛ и ГКЛ

В чем же разница? Как вы, наверное, успели заметить, эти материалы очень востребованы потребителями, зачастую даже профессионалам трудно отдать предпочтение одному из них. Выбор зависит от поставленной задачи, которую должен выполнить материал. Отличительные особенности сведены в таблицу:

Основные отличия же сводятся к технологии производства гипсокартона и гипсоволокна. В данном случае ГКЛ получают путем наклеивания картона на спрессованный картон, а в случае с ГВЛ процесс происходит иначе: здесь гипс армируют целлюлозой (измельченной макулатурой). Гипс со специальными добавками смешивают с этой макулатурой и после чего прессуется.

В итоге, после такого процесса гипсоволокнистый лист имеет большую прочность, в отличие от гипсокартонного, а также более высокие пожароустойчивые характеристики, за это ГВЛ так ценится в специальном строительстве. Гипсокартон же особо ценится при выравнивании стен, поскольку он гладкий и не требует дополнительной обработки перед нанесением отделочного материала.

Отличие ГВЛ и ГКЛ

1. ГКЛ дешевле, чем ГВЛ.

2. ГВЛ обладает более высокой пожароустойчивостью, что позволяет использовать его в производственных сооружениях.

3. Гипсокартон очень востребован, поскольку резать его очень легко, а также хорошо поддается изгибам. Это ценится при создании конструкций подвесных потолков и прочих элементах дизайна.

4. Гипсоволокно является наиболее прочным материалом, с его помощью можно монтировать перегородки.

Гипсоволокнистые или гипсокартонные листы: отличия ГКЛ от ГВЛ

 

 

Гипсокартон известен давно и успел стать одним из наиболее востребованных строительных материалов. Гипсоволокнистые листы (ГВЛ) пока менее распространены, но по своим характеристикам обычный гипсокартон превосходят. Рассмотрим особенности этого материала и варианты использования.

 

 

Гипсоволокнистый лист включает в себя, конечно же, строительный гипс, целлюлозную распущенную макулатуру и определённые технологические добавки. Примерно 80% состава — это именно гипс, 20% занимает целлюлоза. Главное внешнее отличие ГВЛ от гипсокартона — у него нет внешней оболочки, лист получается однородным. При этом одна сторона листа отшлифована, а сама панель пропитала гидрофобизатором, который выполняет роль грунтовки и используется против меления.

Существует ГОСТ Р 51829–2001, который выделяет следующие виды гипсоволокнистых листов:

·       ГВЛ и ГВЛВ, то есть обычные и влагостойкие. В этом отношении гипсоволокно похоже на гипсокартон, который тоже делится на два аналогичных вида, предназначенных для сухих и влажных помещений.

·       С прямой и фальцевой кромкой.

·       Стандартная длинна ГВЛ может составлять 1,5, 2, 2,5, 2,7 и 3 м. Стандартная ширина—0,5, 1 и 1,2 м. Толщина — 10, 12,5, 15, 18 и 20 мм.

Маркируются гипсоволокнистые листы следующим образом: ГВЛВ-ПК-2500х1200х10 ГОСТ Р 51829–2001, где ПК, соответственно, означает прямую кромку.

 

 

 

Технические характеристики ГВЛ:

·       Плотность достигает 1250 кг/м³, что позволяет спокойно забивать в гипсоволокнистые листы гвозди, не боясь, что они начнут крошиться.

·       Материал тёплый на ощупь и обладает низким коэффициентом теплопроводности, то есть может использоваться для утепления комнаты изнутри.

·       Звукоизоляция в зависимости от толщины листа составляет 35–40 ДБ.

·       ГВЛ не горят, относятся к группе Г1 по горючести, группе В1 по воспламеняемости и группе Д1 по дымообразующей способности.

·       Материал не боится морозов, поэтому его можно использовать в помещениях, которые не отапливаются, в том числе при отделке балконов и лоджий.

По показателям морозостойкости, плотности, звукоизоляции ГВЛ значительно превосходят гипсокартон.

 

 

Гипсоволокнистые плиты особенно часто применяются для монтажа полов по сухой технологии. Они способны заменить обычный бетон, в помещении будет более комфортный климат, а сам процесс укладки получается куда более простым и быстрым.

Однако на этом область применения ГВЛ не заканчивается, их можно использовать в следующих случаях:

·       создании подвесных потолков;

·       обшивке стен — в обеих случаях используются листы с фальцевой кромкой;

·       обшивке различных деревянных конструкцию, которые негорючие листы способны защитить от пожара;

·       обшивке мансард, подвалов, балконов;

·       строительстве детских игровых комнат, кортов и других спортивных помещений.

 

 

К положительным свойствам гипсоволокнистых плит можно отнести экологическую чистоту, что позволяет использовать их даже в детских комнатах. Кроме того, они более прочные и износостойкие, при разрезе края не крошатся, как у гипсокартона. Однако ГВЛ весят существенно больше ГКЛ, именно по этой причине они чаще используются для пола и стен, чем для потолка. Ещё один минус — более высокая цена — гипсоволокно стоит примерно в два раза дороже гипсокартона.

 

http://www.rmnt.ru/ — сайт RMNT.ru

Эффект трансплантата против лейкемии — обзор

Эффект трансплантата против лейкемии

Реакция GVL относится к способности донорских иммунных клеток устранять лейкозные клетки хозяина после аллогенной ТГСК. В 1956 году Барнс и др. были первыми, кто сообщил об излечении лейкемии у мышей после тотального облучения тела и ТГСК. Основные сведения о его механизмах были представлены в эпохальном исследовании Международного реестра трансплантатов костного мозга в 1990 г. [99]. Поразительно, что последнее исследование, основанное на данных более чем 2000 субъектов, показало, что GVL отменяется, если в трансплантате истощаются Т-клетки или если донор HSCT является идентичным близнецом.На основании этих данных был сделан вывод, что GVL зависит от донорских Т-клеток и от существования различий в гистосовместимости между донором и его реципиентом (обзор в [100]).

Эффект GvL был подробно рассмотрен в другом месте [100–102], и почти каждая глава в этой книге была нацелена на рассмотрение относительного вклада различных клеточных субпопуляций, вовлеченных в его генезис. Хотя доказательства эффекта GVL после аллогенного HSCT в настоящее время хорошо приняты, механизмы, участвующие в этом эффекте, полностью не известны.Однако, поскольку GVHD тесно связан с GVL, можно предположить, что аналогичные механизмы контролируют GVHD и GVL. GVHD требует распознавания донорскими Т-клетками антигенов, представленных молекулами MHC на клетках-реципиентах, инициирующих клональную экспансию респондеров и эффекторный ответ с участием лимфоцитов и цитокинов. При РТПХ это приводит к клиническим проявлениям острой и хронической РТПХ. В реакциях GVL аллогенный ответ подавляет остаточный лейкоз. Реакции GVHD направлены против широкого спектра тканей, включая BM.Доминирующие антигены лейкозных клеток, вызывающие GVL-ответ, неизвестны: основные или второстепенные антигены гистосовместимости, коэкспрессированные на мишенях GVHD (таких как нормальные клетки кожи и кишечника), и лейкозные клетки могут вызывать неспецифический аллогенный ответ GVH / GVL. Ответ против нормальных или злокачественных клеток костного мозга также может перекрываться. Таким образом, GVL может частично представлять собой эффект «трансплантат против гематопоэта», вовлекающий лимфоидные или миелоидные клоны, или и то, и другое. Кроме того, лейкозные клетки могут вызывать более специфический аллогенный ответ, если они экспрессируют антигены, которые либо не присутствуют, либо недостаточно экспрессируются в клетках других тканей (см. Главу 7).

Отделение GVHD от GVL было успешно выполнено на моделях мышей с использованием различных стратегий, включая истощение аллореактивных Т-клеток; угнетение воспалительных цитокинов; вмешательство в цитолитические пути Т-клеток, костимуляторные пути и трафик; очищение Т-клеток от определенных состояний активации; и использование популяций иммуносупрессивных клеток, включая регуляторные Т-клетки и естественные Т-клетки-киллеры [100–102]. Было обнаружено, что естественные клетки-киллеры вносят существенный вклад в GVL-ответы, которые ранее считались в значительной степени опосредованными только Т-клетками.Т-клеточная терапия продолжает оставаться одной из основных областей интереса. Исследователи идентифицировали несколько типов антигенов, которые распознаются аллогенными Т-клетками, включая различные MiHA (обзор в главе 3), а также опухолеспецифические антигены (обзор в главе 7), включая протеиназу 3 (Pr3; также известный как миелобластин). ), Опухоль Вильмса 1 (WT1) и BCR – ABL. Это позволило размножить антиген-специфические Т-клетки с использованием методов культивирования, в которых Т-клетки выращивают ex vivo в присутствии APC, целевого антигена и поддерживающих цитокинов.Совсем недавно в терапевтическом арсенале алло-НСТ были внедрены методы генно-инженерной терапии Т-клетками и задействование иммунной системы для GvL (см. Главу 8). Методы генной инженерии могут наделить Т-клетки опухолевой специфичностью путем введения ранее клонированных генов антиген-специфичных Т-клеточных рецепторов или модифицированных Т-клеточных рецепторов генов, называемых химерными антигенными рецепторами, которые распознают внеклеточные белки, экспрессируемые опухолями. Действительно, такие подходы использовались для снижения бремени лейкемии в качестве моста к трансплантации (или для лечения рецидива после трансплантации у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями [Brentjens RJ, Sci Transl Med 177: 177ra38, 2013; Maude SL, NEJM 371: 1507-17, 2014]).

Болезнь трансплантат против хозяина в сравнении с лейкемией трансплантат против хозяина | Гематология, Образовательная программа ASH

Аллогенная трансплантация гемопоэтических клеток (HCT) — это признанная терапия широкого спектра гематологических злокачественных новообразований, состояний недостаточности костного мозга и генетических заболеваний. После трансплантации донорские Т-клетки выполняют множество функций, таких как усиление приживления, защита от оппортунистических инфекций и, в случае злокачественных новообразований, отторжение основного заболевания.Однако эти же Т-клетки также вызывают болезнь «трансплантат против хозяина» (РТПХ), которая может варьироваться от легкой кожной сыпи до опасного для жизни, а в некоторых случаях и смертельного осложнения (рис. 1). РТПХ и риск оппортунистических инфекций ограничивают потенциальную пользу аллогенной HCT, которая также может быть эффективной терапией для лечения пациентов с тяжелыми аутоиммунными расстройствами, индукции толерантности к трансплантации органов и, возможно, других клинических условий, если эти проблемы могут быть эффективно решены. .В течение нескольких десятилетий было признано, что основным преимуществом аллогенной HCT является эффект трансплантата против лейкемии (GVL), который является результатом донорских Т-клеток, способных распознавать остаточные опухолевые клетки и отторгать эти клетки, что приводит к значительному снижению риска. рецидива. Концепция GVL была разработана на основе множества доказательств, включая повышенный риск рецидива после сингенной трансплантации, вывод о том, что истощение Т-лимфоцитов привело к снижению риска РТПХ, но также к увеличению частоты рецидивов, снижению частоты рецидивов, связанных с хронической РТПХ, и наконец, полезность инфузий донорских лейкоцитов (DLI) для лечения пациентов, страдающих рецидивом после аллогенной HCT, на который некоторые пациенты реагируют, часто с длительными ремиссиями.Таким образом, концепция о том, что трансплантат может оказывать противоопухолевое действие, хорошо известна в данной области и является основой механизма того, как аллогенная HCT может потенциально вылечить пациентов со сложными, часто рефрактерными гематологическими злокачественными новообразованиями. Несмотря на принятие концепции GVL, нет единого мнения о клетках, ответственных за этот эффект, кроме явно вовлеченных Т-клеток или целевых структур, распознаваемых на опухолевых клетках. Кроме того, клинически признано, что пациенты с некоторыми заболеваниями, такими как хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз и лимфомы низкой степени злокачественности, являются лучшими мишенями для эффектов GVL, чем такие заболевания, как болезнь Ходжкина и острый лимфобластный лейкоз с другими промежуточными являются такие заболевания, как неходжкинская лимфома, острый миелогенный лейкоз и множественная миелома.Биологическое объяснение этого клинического наблюдения не выяснено.

Различия между реактивностью трансплантат против лейкемии и реактивностью трансплантат против хозяина. I. Взаимодействие донорских иммунных Т-клеток с опухолью и / или клетками-хозяевами

Реакции трансплантат против лейкемии (GVL) и трансплантат против хозяина (GVH) сравнивали после системного переноса аллогенных противоопухолевых иммунных Т-лимфоцитов из B10.D2 (H-2d; Mls (b)) в DBA / 2 (H- 2г; Mis (a)) мыши.Перед переносом иммунных клеток мышей-реципиентов DBA / 2 сублетально облучали 5 Гр для предотвращения реактивности «хозяин против трансплантата». Реципиенты были либо с сингенными метастатическими лимфомами ESb (система GVL), либо были нормальными мышами, не несущими опухоли (система GVH). Ранее мы сообщали, что этот протокол адоптивной иммунотерапии (ADI) обладал выраженной активностью GVL и приводил к иммунному отторжению даже распространенного метастазирующего рака. В этом исследовании моноклональные антитела использовались для иммуногистохимического анализа нативных замороженных срезов ткани селезенки или печени, чтобы отличить донор от клеток-хозяев, дифференцировать CD4 и CD8 Т-лимфоциты и окрашивать сиалоадгезин-положительные макрофаги в разные моменты времени после клетки. передача.Кинетика инфильтрации донорских клеток в селезенке и печени различалась тем, что лимфоидный орган инфильтрировался раньше (дни с 1 по 5 после переноса), чем нелимфоидный орган (дни с 5 по 20). После достижения пика инфильтрация донорскими клетками постепенно снижалась и не определялась в селезенке после 20-го дня и в печени после 30-го дня. Донорские иммунные клетки, инфильтрирующие орган, были в основном Т-лимфоцитами и имели положительную окраску на маркеры Т-клеток CD4 или CD8. . Замечательное наблюдение, связанное с GVL, было сделано в отношении подмножества макрофагов, несущих молекулу адгезии сиалоадгезин (SER + макрофаги).В печени мышей, несущих опухоль, их количество увеличивалось между 1 и 12 днями после ADI более чем в 30 раз. Двойное окрашивание на маркер донорских клеток и SER показало, что макрофаги, экспрессирующие сиалоадгезин, имеют происхождение от хозяина. Макрофаги хозяина SER + из печени GVL были выделены перфузией фермента и розеткой через 12 дней после ADI, когда они достигли пикового значения около 60 клеток на дольку печени, и были протестированы без дополнительного добавления антигена на их способность стимулировать противоопухолевый CD8 T. -cell ответ.Результаты этого иммунологического анализа позволяют предположить, что эти клетки в печени функционируют как поглотители разрушенных метастазов и как клетки, обрабатывающие и представляющие антиген, для противоопухолевых иммунных Т-клеток.

Эквиваленты

Международного бакалавриата (IB) | Технический колледж Гринвилля

ПРЕДМЕТНЫЙ ЭКЗАМЕН	ОЦЕНКА	ВЫДАН КРЕДИТА
Антропология, социальная и культурная жизнь HL	4-7	АНТ 101
Биология HL	4	БИО 101
Биология HL	5-7	БИО 101 и БИО 102
Автобус.Управление HL	4-7	MGT 101
Химия HL	4	ЧМ 110
Химия HL	5-7	CHM 110 и CHM 111
китайский	4-7	ELC 163
Компьютерные науки HL	4-7	CPT 230
Технологии проектирования HL	4-7	ELC 112
Экономика HL	4	ЭКО 210
Экономика HL	5-7	ЭКО 210 и ЭКО 211
Французская литература HL	4-7	ELC 124
Французский язык и литература HL	4-7	ELC 124
французский B	4	FRE 101
французский B	5	FRE 101 и FRE 102
французский B	6	FRE 101, FRE 102, FRE 201
французский B	7	FRE 101, FRE 102, FRE 201, FRE 202
География HL	4-7	GEO 101
Немецкая литература A HL	4-7	ELC 125
Немецкий язык A Lang & Lit HL	4-7	ELC 125
Немецкий B HL	4	GER 101
Немецкий B HL	5	GER 101 и GER 102
Немецкий B HL	6	GER 101, GER 102, GER 201
Немецкий B HL	7	GER 101, GER 102, GER 201 и GER 202
Ист.Америка HL	4-7	ЕГО 201
Ист. Африка	4-7	ЕГО 106
Ист. Азия / Северная Африка HL	4-7	ELC 111
Ист. Европа HL	4-7	ЕГО 101
Ист. Исламский HL	4-7	ELC 111
Ист.Океания HL	4-7	ЕГО 108
Информационные технологии в глобальном обществе	4-7	HSS 105
Английский A Литература HL	4	РУС 101
Английский A Литература HL	5-7	РУС 101 и РУС 102
Английский A Lang & Lit.	4-7	РУС 101 и РУС 102
Латиница HL	4-7	ELC 163
Математика HL	4	MAT 140 или MAT 130 (в зависимости от программы обучения)
Математика HL	5-7	MAT 140 и MAT 141 или MAT 130 и MAT 230 (в зависимости от программы обучения)
Музыка HL	4-7	MUS 105
Философия HL	4-7	PHI 101
Физика HL	4	ФИЗ 201
Физика HL	5-7	PHY 201 и 202
Психология HL	4-7	фунтов / кв. Дюйм 201
Испанская литература A HL	4-7	ELC 123
Испанский A Lang.& Горит HL	4-7	ELC 123
Испанский B	4	SPA 101
Испанский B	5	SPA 101 и 102
Испанский B	6	SPA 101, SPA 102, SPA 201
Испанский B	7	SPA 101, SPA 102, SPA 201, SPA 202
Театр	4-7	ТЕ 101
Визуальные АР	4-7	АРВ 121

TCF-1 в Т-клетках CD8 отделяет GVHD от GVL

Введение

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-HSCT) — это лечебная терапия, часто используемая при злокачественных гематологических заболеваниях (1).Зрелые донорские Т-клетки, обнаруженные в трансплантате, становятся аллоактивированными после распознавания HLA-хозяина как чужеродного (2, 3). Это приводит к пролиферации Т-клеток, миграции к органам-мишеням и продукции цитокинов (4). Эти активности Т-клеток помогают очистить остаточные злокачественные клетки, что называется эффектом трансплантата против лейкемии (GVL) (5) (6). Однако от 30 до 70 процентов пациентов также страдают от болезни «трансплантат против хозяина» (GHVD) — серьезного осложнения, вызываемого теми же зрелыми донорскими Т-клетками (6). Повреждение здоровых тканей хозяина во время РТПХ является серьезной проблемой для широкого использования алло-ТГСК (7–9).Наша и другие работы сосредоточены на модуляции передачи сигналов донорскими Т-клетками для разделения связанных процессов GHVD и GVL (9–11). В этой рукописи, а также в нашей сопутствующей рукописи мы обращаемся к роли Т-клеточного фактора-1 (TCF-1), основного фактора транскрипции Т-клеток, в регуляции этих процессов (12). TCF-1 участвует в Wnt сигнальный путь, и он важен для развития Т-клеток, а также для активации (12-14). Однако неизвестно, регулирует ли TCF-1 также зрелые аллоактивированные Т-клетки и может ли модуляция этого фактора влиять на GVHD или GVL.Сообщалось, что TCF-1 контролирует эомезодермин (Eomes) и, возможно, фактор транскрипции T-box 21 (T-bet), два нижестоящих фактора транскрипции, которые, как известно, участвуют в GVHD и GVL (10, 15, 16). Таким образом, мы предположили, что TCF-1 также может влиять и, возможно, разделять эти процессы.

Используя мышиную модель GVHD и GVL после алло-HSCT, мы смогли изучить все основные функции Т-клеток, а также фенотипы, клинические исходы и экспрессию генов на одной модели.Мы также использовали уникальный штамм мышей, который имеет делецию TCF-1 в зрелых Т-клетках, а не глобальную делецию (17). Эта мышь Tcf7 flox / flox x CD4cre испытывает делецию TCF-1 во всех Т-клетках на двойной положительной фазе развития, когда все Т-клетки экспрессируют CD4 (17). Это позволяет нам преодолеть серьезный дефект развития Т-клеток, который возникает при глобальной делеции TCF-1, поскольку TCF-1 является критическим для дважды отрицательной стадии развития (17). Используя эти инструменты, мы обнаружили, что потеря TCF-1 снижает как тяжесть, так и устойчивость GVHD, управляемой CD8-Т-клетками, но поддерживает GVL-функциональность зрелых аллоактивированных CD8-T-клеток.Для снижения РТПХ это в первую очередь связано с уменьшением продукции цитокинов, повышенной предрасположенностью к апоптозу, повышенным истощением и, возможно, уменьшением пролиферации аллоактивированных донорских Т-клеток, а также с увеличением количества центральных клеток памяти на исходном уровне (18–20). Эффекты GVL сохраняются в отношении жидких опухолей благодаря повышенной активации донорских Т-клеток и продукции цитотоксических медиаторов перфорина и гранзима B (21, 22). Мы показали, что потеря TCF-1 вызывает присущие Т-клеткам фенотипические изменения, которые способствуют эффектам GVL при одновременном нарушении GVHD, включая повышенную экспрессию центральной памяти Eomes, T-bet, CD122, CD44 и CD8.Частота активации / перехода Т-клеток CD8 снижалась, когда TCF-1 был потерян. Потеря TCF-1 влияет на экспрессию хемокиновых рецепторов на донорских Т-клетках, что ранее было неизвестно (18).

Потеря TCF-1 также повлияла на пути дифференцировки Т-клеток, адгезию клеток, передачу сигналов (MAPK, NFkB, кальций, TCR, NOD, TNF и другие), клеточный цикл, некроптоз, старение клеток, аутофагию, метаболизм и репликацию ДНК. (22).

Недавние сообщения идентифицировали новую подгруппу CD8 + Т-клеток, которые экспрессируют CXCR5, маркер, традиционно связанный с Т-фолликулярными хелперами (23).Считается, что эти CXCR5 + CD8 + T-клетки похожи на стволовые и помогают поддерживать пулы CD8 T-клеток во время хронических реакций на антиген (24). Эти клетки описаны в ситуациях, когда антиген присутствует постоянно, например, при хронических инфекциях (25). Мы предположили, что эти клетки также могут играть роль в GVHD, когда повреждающее заболевание сохраняется с течением времени, а воздействие аллоантигена в организме хозяина является хроническим (26). Действительно, мы обнаружили, что CXCR5 + CD8 + Т-клетки присутствуют у мышей, страдающих РТПХ от CD8 + Т-клеток дикого типа.Пиковая частота этих клеток коррелировала во времени с пиковой клинической оценкой. Кроме того, у мышей, получавших TCF cKO CD8 + T-клетки, наблюдались более низкие частоты донорских CXCR5 + CD8 + T-клеток, что позволяет предположить, что эти клетки могут быть важны для поддержания ответов GVHD с течением времени.

Таким образом, TCF-1 контролирует фенотип зрелых Т-лимфоцитов CD8 и функционирует во время аллоактивации, что является новым открытием. Вместе с нашей сопутствующей статьей мы показали, что регулирование зрелых аллоактивированных CD4 по сравнению с CD8 Т-клетками с помощью TCF-1 отличается.Модуляция передачи сигналов TCF-1 и Wnt может быть успешным вариантом отделения GVHD от GVL для улучшения результатов лечения пациентов после алло-HSCT. Мы также определили роль CXCR5 + CD8 + T-клеток в GVHD, обеспечивая еще одну потенциальную мишень для модуляции T-клеток для улучшения результатов лечения пациентов.

Результаты

Потеря TCF-1 в донорских Т-лимфоцитах CD8 снижает тяжесть и стойкость симптомов РТПХ

В большинстве предыдущих исследований TCF-1 использовался глобальный нокаут TCF-1, поскольку основное внимание уделялось TCF-1 роль как фактор развития.Однако мы хотели изучить роль TCF-1 в зрелых Т-клетках. Глобальная потеря TCF-1 приводит к минимальному производству Т-клеток из тимуса, потому что TCF-1 имеет решающее значение для стадий развития DN. Таким образом, мы получили мышей с Т-клеточно-специфическим нокаутом TCF-1 (Tcf7 flox / flox x CD4cre, здесь называется TCF cKO (17). Это позволило нам изучить зрелые Т-клетки, которые нормально развивались в тимусе, а затем теряли экспрессию. TCF-1 в фазе DP

Чтобы определить, играет ли TCF-1 роль в регуляции зрелых аллоактивированных Т-клеток, которая в настоящее время неизвестна, мы использовали мышиную модель MHC-несоответствующего алло-HSCT, ведущего к GVHD и GVL.Вкратце, мышей BALB / c (гаплотип d MHC) смертельно облучали и трансплантировали BALB / c костный мозг и C57Bl / 6-фоновые (MHC гаплотип b) Т-клетки донора CD8 (10). Донорские клетки были получены от мышей дикого типа (WT), CD4cre-позитивных (CD4cre) или TCF-1-дефицитных (TCF cKO) мышей. Реципиентам давали 1 × 10 ⁶ Т-клеток CD8 и 10 × 10 ⁶ BALB / c T-клеточных истощенных клеток костного мозга, а также 2 × 10 ⁵ B-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL) опухолевые клетки (27) для оценки ответов GVL (10).B-ALL является сингенным для мышей BALB / c и аллогенным для мышей C57BL / 6 (B6) (10). Несоответствие гаплотипов MHC между клетками-хозяевами и донорами приводит к аллоактивации донорских Т-клеток, что, в свою очередь, вызывает эффекты GVHD и GVL. Для изучения тяжести и прогрессирования заболевания мышей-реципиентов взвешивали и выставляли клиническую оценку три раза в неделю после трансплантации примерно до 60 дней (фиг. 1A) . Мышей оценивали на основе шести факторов: целостности кожи, текстуры шерсти, осанки, уровня активности, потери веса и диареи (28).

Рис. 1. Потеря TCF-1 в донорских Т-лимфоцитах CD8 снижает тяжесть и стойкость симптомов РТПХ.

мышей-реципиентов BALB / c (гаплотип D MHC) были смертельно облучены и аллотрансплантированы 1 × 10 ⁶ Т-клеток CD8 от мышей-доноров WT, CD4cre или TCF cKO (гаплотип b MHC), а также 10 × 10 ⁶ Клетки костного мозга (КМ) с истощенными Т-клетками от мышей BALB / c (гаплотип d MHC). Мышам-реципиентам также давали 2 × 10 ⁵ опухолевых клеток B-ALL, экспрессирующих люциферазу (10, 40). (A) Мышам-реципиентам давали клиническую оценку GVHD три раза в неделю до дня 66 на основе комбинированных оценок текстуры шерсти, уровня активности, потери веса, положения тела, целостности кожи и диареи.Среднее и стандартное отклонение нанесены на график, проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. (B) Бремя заболевания, определяемое количеством мышей в каждой группе, которые умерли к концу эксперимента. Процент и количество мышей указаны над полосой для каждой группы. (C) Выживаемость для каждой группы мышей-реципиентов в течение 66 дней после трансплантации, проанализированная анализом выживаемости Каплана-Мейера. (D) На 7, 14 и 21 день после трансплантации у мышей-реципиентов брали органы для гистологического анализа.Кожа, печень, селезенка и тонкий кишечник были разделены на срезы, окрашены H&E и оценены патологом (AM), не имеющим отношения к условиям исследования и группам предметных стекол. Показаны репрезентативные секции для каждого органа в каждой группе и в определенный момент времени. Стрелки указывают на повреждение тканей или инфильтрацию лимфоцитов. (E) Гистологические оценки для каждой группы мышей, показанные как процент мышей в группе, испытывающих эту оценку. 3-4 степени считаются тяжелой РТПХ, а степени 0-2 — легкой РТПХ. Данные были проанализированы с помощью анализа хи-квадрат.Для всех графиков * означает p-значение ≤ 0,05, *** означает p-значение ≤ 0,001, а **** означает p-значение ≤ 0,0001. N = 3-5 на группу для AC с одним показанным репрезентативным экспериментом, N = 3 на группу для DE , показана одна репрезентативная фотография и сводные данные в E.

Мы обнаружили, что мыши, получавшие WT от донора T. клетки имели быстрое увеличение тяжести GVHD с высоким пиком примерно на 7 день, что указывает на тяжелую GVHD (Fig. 1A) . Этот высокий балл сохранялся до тех пор, пока мыши-реципиенты не умерли от болезни, что указывает на стойкое заболевание (рис.1А) . Бремя заболевания, определяемое по проценту мышей в каждой группе, умерших во время эксперимента, было высоким для мышей с трансплантированными дикими животными (рис. 1B) . WT-трансплантированные мыши сначала теряли вес и были неспособны снова набрать вес ( Supp. Fig. 1A) . Большинство мышей, которым вводили Т-клетки дикого типа, также умерли до дня 60 (фиг. 1A-C). Мыши-реципиенты, которым вводили Т-клетки CD4cre, не показали значительных различий в выживаемости или клинической оценке по сравнению с мышами, получавшими Т-клетки дикого типа (рис.1A-C), (Дополнение Рис. 1A) . Напротив, мыши, которым вводили TCF cKO T-клетки, имели гораздо лучшую выживаемость, более низкие пиковые и средние клинические показатели, меньшее бремя болезни и прибавку в весе после начального периода потери веса (Рис. 1A-C), (Supp. Fig. 1А) . Кроме того, клинические показатели для этих мышей быстро снизились до уровня, близкого к контролю, после пика на 7 день (фиг. 1A) , что свидетельствует о том, что заболевание не сохраняется у этих мышей. Следовательно, потеря TCF-1 в донорских Т-клетках привела к снижению тяжести и устойчивости РТПХ с улучшением выживаемости.

Сводная фигура: TCF-1 отделяет GVHD от GVL, регулируя зрелые аллоактивированные Т-клетки CD8.

Т-клеточный фактор-1 (TCF-1) представляет собой фактор транскрипции Т-клеток, участвующий в пути Wnt. Условная делеция TCF-1 в Т-клетках приводила к снижению GVHD, но сохраняла эффекты GVL снова на опухолевые клетки B-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL). Это произошло в первую очередь из-за: снижения продукции и пролиферации цитокинов; усиление апоптоза, истощения и выработки цитотоксических медиаторов; и измененная экспрессия генов.Наблюдаемое снижение количества CXCR5 + CD8 + Т-клеток также могло способствовать снижению тяжести РТПХ. Эти изменения привели к уменьшению повреждения органов-мишеней (печени, кожи и тонкого кишечника), но CD8 Т-клетки все еще были способны очищать опухолевые клетки.

Дополнительный рисунок 1. Симптомы GVHD и повреждение органов, вызванные донорскими CD8 T-клетками, уменьшаются за счет потери TCF-1, что связано с рисунком 1.

реципиентным мышам BALB / c аллотрансплантировали BALB / c BM и WT, CD4cre или TCF cKO CD8 Т-клетки, как показано на рис.1. (A) Изменения веса для каждой группы мышей в течение эксперимента, среднее значение и стандартное отклонение нанесены на график. (B) Гистологическая оценка GVHD для срезов органов (печень, селезенка, кожа и тонкий кишечник), взятых у мышей-реципиентов с аллотрансплантацией на 7-й, 14-й и 21-й день после трансплантации. Срезы оценивали патолог (AM), не знающий условий исследования и идентичности слайдов. На графике нанесены отдельные точки с отображением медианы. (C) Показаны репрезентативные фотографии срезов селезенки с 7-го и 21-го дня.N = 3-5 на группу с одним репрезентативным экспериментом, показанным в A, сводные данные с точками в B и одна репрезентативная фотография на штамм / время в C.

Во время GVHD ткани хозяина повреждаются активностью аллоактивированных Т-клеток. Чтобы определить, изменилось ли повреждение органов-мишеней РТПХ (кожи, печени и тонкого кишечника, также известного как «кишечник») потерей TCF-1 в донорских Т-клетках, мы собрали органы у мышей, аллотрансплантированных, как описано выше. На 7-й, 14-й и 21-й день после трансплантации мы собрали кусочки кожи, тонкой кишки и печени у мышей-реципиентов BALB / c.Эти органы фиксировали, делали срезы, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и оценивали патологом (A.M.), не имеющим отношения к исследуемой группе и типу донора (рис. 1D) . На 7 день практически не наблюдается различий между WT- и TCF-трансплантированными cKO органами, за исключением тенденции к снижению медианного уровня в кишечнике для TCF-трансплантированных cKO-мышей (Supp. Fig. 1B) . Это коррелирует с наблюдением, что до 7-го дня течение заболевания в обеих группах было одинаковым, с уменьшением пикового балла на 7-й день (рис.1А) . К 21 дню наблюдались достоверные различия в количестве мышей в группе с тяжелой и легкой степенью РТПХ (3-4 для тяжелой степени против 0-2 для отсутствия и средней степени) (29) (30) для печени и кожи, с WT. -трансплантированные мыши с более тяжелым заболеванием (фиг. 1E) . Кроме того, средний балл для всех органов имел тенденцию к снижению для TCF-трансплантированных cKO мышей, что коррелировало с инфильтрацией лимфоцитов и повреждением тканей, наблюдаемыми на слайдах (Дополнение Рис. 1B-C) .Эти изменения уже были видны к 14 дню как тенденция, предполагая, что у мышей, которым трансплантировали TCF cKO, изменилось течение болезни после пика баллов на 7 день (Supp. Fig. 1B-C) . В целом эти данные предполагают, что TCF-1 обычно способствует повреждению здоровых тканей GVHD и необходим для того, чтобы Т-клетки вызывали это повреждение. Таким образом, потеря TCF-1 в донорских Т-клетках приводит к снижению тяжести и устойчивости РТПХ с течением времени.

TCF-1-дефицитные Т-клетки CD8 сохраняют противоопухолевые возможности для эффекта «трансплантат против лейкемии» (GVL)

Мы показали, что TCF-1-дефицитные донорские Т-клетки снижают тяжесть и стойкость и РТПХ.Однако клинически оптимально, если эффекты GVL сохраняются, несмотря на снижение GVHD, потому что одни и те же донорские Т-клетки опосредуют оба эффекта. Поэтому мы проверили, были ли эффекты GVL скомпрометированы потерей TCF-1 в донорских Т-клетках. Мы использовали модель мыши алло-HSCT, описанную на рис. 1, для оценки ответов GVL. Клетки B-ALL экспрессировали люциферазу (10), что позволяет нам отслеживать их, вводя D-люциферин мышам-реципиентам и визуализируя их с помощью сканера биолюминесценции in vivo (IVIS 200).Мышей взвешивали, оценивали и сканировали три раза в неделю до конца эксперимента (фиг. 2) .

Рисунок 2: CD8-T-клетки с дефицитом TCF-1 сохраняют противоопухолевые возможности для эффекта трансплантат против лейкемии (GVL).

мышей BALB / c аллотрансплантировали, как показано на фиг. 1, с истощенными Т-клетками BM и WT, CD4cre или TCF cKO CD8 донорскими Т-клетками вместе с 2 × 10 ⁵ экспрессирующих люциферазу опухолевых клеток B-ALL. Затем мышам-реципиентам вводили D-люциферин (внутрибрюшинно) и получали изображения с помощью системы визуализации IVIS 200. (A) Репрезентативный набор фотографий, показывающих биолюминесценцию опухоли и локализацию для трансплантированных групп. Контрольных мышей не трансплантировали, мыши BM + BLL получали только BM и опухолевые клетки, в то время как другие группы получали BM, опухолевые клетки и Т-клетки CD8 доноров WT, CD4cre или TCF cKO. Прямоугольники с «X» указывают на смерть от РТПХ или опухоли, * означает, что изображение было насыщенным из-за слишком высокого уровня сигнала, поэтому изображение не отображается. (B) Количественная оценка сигнала биолюминесценции для каждой мыши в трансплантированных группах для одного репрезентативного эксперимента, как определено по общему потоку (фотонов в секунду).Примечание: 3 мыши из группы BM + BLL luc в этом эксперименте имели насыщенные сигналы, поэтому данные были исключены. (C) Опухолевая нагрузка только для опухоли, опухоли с WT CD8 и опухоли с группами TCF cKO CD8, как определено по количеству / проценту мышей, показывающих биолюминесценцию опухоли и наличие опухоли в конце эксперимента. N = 3-5 на группу с показанным одним репрезентативным экспериментом.

В день 1 после трансплантации мыши-реципиенты из всех групп (только B-ALL luc + BM, B-ALL luc + BM + WT CD8 Т-клетки, B-ALL luc + BM + TCF cKO CD8 Т-клетки и B -ALL luc + BM + CD4cre CD8 T-клетки) показали определяемые уровни опухолевых клеток в своих телах (рис.2А) . Было введено 2 × 10 ⁵ опухолевых клеток, так что они были немедленно обнаружены, но не подавляющими для донорских Т-клеток (10). Со временем группа, получавшая только костный мозг и опухолевые клетки, показала значительное увеличение роста опухоли (фиг. 2A-B) , потому что не присутствовали Т-клетки, чтобы контролировать опухолевые клетки. Напротив, большинство мышей, получавших CD8 Т-клетки от любого типа донора вместе с BM и B-ALL luc, смогли очистить опухолевые клетки к концу эксперимента (рис.2А-Б) . Эффект GVL поддерживался даже у мышей с трансплантированными CD4cre и TCF cKO с небольшой разницей в количественной биолюминесценции между группами (фиг. 2B) . Бремя опухоли также было сходным у мышей с трансплантированными WT и TCF cKO (фиг. 2C) . Как показано ранее на фиг. 1, мыши в группах WT и CD4cre умерли от GVHD с течением времени, но мыши в группе TCF cKO имели легкую GVHD, которая разрешилась со временем (Fig. 1A, 2A) . В целом эти данные показывают, что TCF-1 незаменим для эффектов GVL, но критически важен для GVHD.Следовательно, потеря TCF-1 в донорских Т-клетках обеспечивает клинически оптимальный фенотип, при котором тяжесть РТПХ снижается, но благоприятные эффекты GVL сохраняются.

Потеря TCF-1 приводит к изменениям фенотипа зрелых CD8 Т-клеток, которые в первую очередь присущи клеткам.

Аллоактивированные Т-клетки должны выжить, пролиферировать, продуцировать цитокины и мигрировать в органы-мишени, чтобы опосредовать GVHD или GVL. Фенотип донорской Т-клетки также может влиять на ее способность выполнять эти функции и вносить вклад в GVHD / GVL.Чтобы определить, влияет ли потеря TCF-1 на фенотип зрелых донорских Т-клеток, мы выполнили фенотипирование проточной цитометрией на донорских CD8 Т-клетках до трансплантации (рис. 3A-E) . Для начала мы изучили экспрессию эомезодермина (Eomes) и фактора транскрипции T-box 21 (T-bet), оба из которых находятся ниже TCF-1. Известно, что Eomes и T-bet способствуют развитию GVHD, и Eomes также имеет решающее значение для эффектов GVL (10, 31). В некоторых сообщениях утверждается, что Eomes активируется TCF-1 (что означает, что потеря TCF-1 снижает экспрессию Eomes (15).Однако в нашей модели условной делеции TCF-1 мы обнаружили, что TCF cKO CD8 T-клетки обладают повышенной экспрессией Eomes по сравнению с WT CD8 T-клетками (фиг. 3A) . В других отчетах утверждалось, что TCF-1 может быть активирован или не затронут T-bet (14), но мы обнаружили, что потеря TCF-1 привела к увеличению экспрессии T-bet в Т-клетках CD8 (фиг. 3B) . Это предполагает, что TCF-1 обычно подавляет экспрессию Eomes и T-bet в зрелых Т-клетках. Затем мы изучили активацию Т-клеток с использованием CD44 и CD122. Экспрессия CD122 увеличивалась в донорских клетках с дефицитом TCF-1 (рис.3С) . Экспрессия CD44 была более сильной среди CD8 Т-клеток от мышей TCF cKO (фиг. 3D-E) . В некоторых сообщениях предполагается, что Т-клетки CD44 ^hi не вызывают РТПХ или менее тяжелой РТПХ (10, 32). Таким образом, используя CD62L и CD44, мы идентифицировали четыре основных подмножества памяти: центральную память (44+ 62L +), эффекторную память (44+ 62L-), наивные (44-) и активирующие / переходящие (44 средние) клетки. У мышей TCF cKO было увеличено количество Т-лимфоцитов CD8 центральной памяти и уменьшилось количество переходных / активирующих CD8 Т-клеток (рис.3E) . Таким образом, потеря TCF-1 приводит к более искаженному в памяти фенотипу для CD8 Т-клеток. Некоторые сообщения предполагают, что Т-клетки памяти задерживают индукцию РТПХ (10, 32), поэтому это фенотипическое изменение может быть полезным.

Рисунок 3: Потеря TCF-1 приводит к изменениям фенотипа зрелых Т-лимфоцитов CD8, которые в первую очередь присущи клеткам.

(A-E) Наивных мышей-доноров cKO WT или TCF подвергали эвтаназии и окрашивали спленоциты для фенотипирования проточной цитометрии. (A) Процент CD8 Т-клеток, экспрессирующих Eomes. (B) Процент CD8 T-клеток, экспрессирующих T-bet. (C) Процент CD8 Т-клеток, экспрессирующих CD122. (D) Процент CD8 Т-клеток, экспрессирующих CD44. (E) Процент CD8 Т-клеток, экспрессирующих центральную память, эффекторную память, переходные / активирующие или наивные фенотипы. (F-I) Химеры костного мозга были получены путем летального облучения мышей Thy1.1 и воссоздания смесью клеток костного мозга 1: 4 (WT: TCF cKO). Кровь анализировали через 9 недель, чтобы убедиться в восстановлении обоих типов донорских клеток, а спленоциты использовали через 10 недель для фенотипирования с помощью проточной цитометрии. (F) Процент химерных CD8 Т-клеток, экспрессирующих Eomes. (G) Процент химерных CD8 Т-клеток, экспрессирующих T-bet. (H) Процент химерных CD8 Т-клеток, экспрессирующих CD122. (I) Процент химерных CD8 Т-клеток, экспрессирующих центральную память, эффекторную память, наивный или переходный / активирующий фенотип. Все данные представлены в виде отдельных точек со средним значением и стандартным отклонением, все они были проанализированы с помощью однофакторного или двустороннего дисперсионного анализа или критерия Стьюдента (в зависимости от групп).Для всех графиков * означает p-значение ≤ 0,05, *** означает p-значение ≤ 0,001, а **** означает p-значение ≤ 0,0001. Для A-E N = 3 на группу с одним показанным репрезентативным экспериментом, для F-I N = 5 с одним показанным экспериментом (проведенным один раз).

Изменения клеточного фенотипа у «нокаутированных» мышей могут быть внутренними (непосредственно из-за дефицита гена внутри клетки) или внешними (из-за изменений в микроокружении из-за дефицита гена). Чтобы определить, были ли наблюдаемые нами фенотипические эффекты внутренними или внешними, мы разработали химерную модель на мышах.Вкратце, мы смешали костный мозг мышей cKO WT и TCF в соотношении 1: 4 (WT: TCF) для всего 50 × 10 ⁶ клеток BM, затем использовали эту смесь для восстановления смертельно облученных мышей Thy1.1. Мы использовали соотношение 1: 4, чтобы гарантировать выживание KO-клеток (на основании наших первоначальных наблюдений, что TCF cKO T-клетки плохо размножаются в культуре). Через 9 недель после трансплантации брали кровь, чтобы гарантировать восстановление и выживаемость обоих типов доноров у каждой мыши. Через 10 недель спленоциты фенотипировали с помощью проточной цитометрии, при этом донорские клетки идентифицировали по h3Kb, CD45.1 (WT) и CD45.2 (TCF cKO) маркеры (рис. 3F-I) . TCF cKO донорские CD8 Т-клетки из химеры все еще имели повышенную экспрессию T-bet (фиг. 3G) , а экспрессия Eomes и CD122 также была увеличена до уровней, близких к KO в донорских клетках WT (фиг. 3F, H). ) . Это указывает на то, что хотя фенотипические изменения в основном присущи клеткам мышей TCF cKO, также присутствуют некоторые внешние клеточные эффекты. Количество клеток центральной памяти CD8 было снижено в клетках TCF cKO из химеры (а не увеличивалось, как в клетках до трансплантации), что позволяет предположить, что этот эффект является внешним для клеток (рис.3I) . Химерные клетки-доноры TCF cKO также обнаруживают увеличение наивных клеток, что было уникальным для химеры (Fig. 3I) . Уменьшение количества переходных клеток также сохранялось в химерных клетках TCF cKO, подтверждая, что это является внутренним эффектом клетки (Fig. 3I) . Таким образом, фенотипические изменения, индуцированные в CD8 Т-клетках потерей TCF-1, в первую очередь присущи клетке, с некоторыми дополнительными внешними клеточными эффектами.

Потеря TCF-1 изменяет продукцию цитокинов и цитотоксических медиаторов зрелыми аллоактивированными Т-клетками CD8

Одним из отличительных признаков РТПХ является высвобождение провоспалительных цитокинов и цитотоксических медиаторов аллоактивированными донорскими Т-клетками, что в конечном итоге приводит к цитокиновому шторму.Эти медиаторы также вызывают эффект GVL, который убивает остаточные злокачественные клетки. Мы исследовали, приводит ли потеря TCF-1 в донорских Т-лимфоцитах CD8 к изменениям продукции цитокинов или цитотоксических медиаторов, тем самым влияя на повреждение РТПХ. Мы аллотрансплантировали смертельно облученных мышей BALB / c, как описано выше, с мышами, получавшими 1,5 × 10 ⁶ WT или TCF cKO CD3 Т-лимфоцитов вместе с истощенным Т-клетками костным мозгом BALB / c. Реципиентов умерщвляли на 7 день после трансплантации. Спленоциты выделяли и повторно стимулировали через 6 часов культивирования PBS (контроль) или анти-CD3 / анти-CD28 (стимуляция) вместе с Golgiplug.После этого культивированные клетки окрашивали антителами против h3Kb, CD3, CD4, CD8, TNF-α и IFN-γ. Наши данные показали, что продукция TNF-α донорскими CD8 Т-клетками имеет тенденцию к снижению, когда TCF-1 теряется (Рис. 4A) . Напротив, IFN-γ имеет тенденцию к увеличению при потере TCF-1 в CD8 T-клетках (фиг. 4B) . Это говорит о том, что TNF-α более важен для повреждения Т-клетками, связанного с GVHD, чем IFN-γ.

Рисунок 4: Потеря TCF-1 изменяет продукцию цитокинов и цитотоксических медиаторов зрелыми аллоактивированными Т-клетками CD8.

(A-B) Мышам-реципиентам аллотрансплантировали 1,5 × 10 ⁶ WT или TCF cKO донорские CD3 Т-клетки и BALB / c BM, как и ранее. Спленоциты отбирали на 7-й день после трансплантации, повторно стимулировали 6-часовым культивированием с помощью Golgi Plug и PBS (контроль) или анти-CD3 / анти-CD28 (TCR restim.), Затем окрашивали на h3Kb, CD3, CD4, CD8, TNF-α, и IFN-γ. (A) Продукция TNF-α и (B) продукция IFN-γ донорскими CD8 Т-клетками, как измерено в процентах цитокин-положительных донорских клеток. Для A-B отдельные точки нанесены на график со средним значением и стандартным отклонением. (C-G) На 7-й, 14-й и 21-й день после трансплантации получали сыворотку из сердечной крови аллотрансплантированных мышей-реципиентов и тестировали на различные цитокины с использованием анализа LEGENDplex ELISA. (C) Сывороточные уровни (пг / мл) TNF-α для мышей WT и TCF с трансплантированными cKO с течением времени и (D) только на 14 день. (E) Сывороточные уровни (пг / мл) IFN-γ для мышей WT и TCF с трансплантированными cKO с течением времени и (F) только на 14 день. (G) Уровни сыворотки (пг / мл) IL-2 с течением времени для мышей WT и TCF с трансплантированными cKO.Для C, E и G нанесены средние значения с SD, для D и F показаны отдельные точки со средним значением и SD. Все данные в A-G были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента или двухфакторного дисперсионного анализа (в зависимости от групп). ** означает значение p ≤ 0,01, а *** означает значение p ≤ 0,001. (H-L) Донорские Т-клетки CD8 перед трансплантацией и после трансплантации выделяли из селезенок доноров или реципиентных селезенок, трансплантированных WT- или TCF, и лизировали для вестерн-блоттинга. (H) Фотографии блота, показывающие полосы для перфорина, гранзима B и актина.Уровни белка, нормализованные к B-актину, для (I), гранзима B в клетках до трансплантации, (J), перфорина в клетках до трансплантации, (K), гранзима B в клетках после трансплантации и (L ) перфорин в посттрансплантационных клетках. N = 3-5 на группу для AB с двумя показанными экспериментами, n = 5-6 на группу для CG со сводными данными ( C, E, G) или точки (D, F) , показанные из один репрезентативный эксперимент. H-L одна лунка на условие, как показано на блоте, I-L — один эксперимент, нанесенный на график (проведенный один раз).

Мы также получили сыворотку из сердечной крови мышей-реципиентов на 7 день после трансплантации и протестировали ее с помощью ELISA-панели мышиного цитокина Th (набор LEGENDplex от Biolegend). TNF-α в сыворотке мышей, получавших Т-клетки TCF cKO CD8, был ниже, чем у мышей, получавших Т-клетки WT CD8 на 7-й день (фиг. 4C) . Кроме того, уровни TNF-α в сыворотке, по-видимому, снизились за время после 7-го дня для обеих групп мышей, особенно для тех, которым давали WT Т-клетки (фиг. 4C) . При сравнении только сыворотка с 14-го дня также показала значительное снижение уровней TNF-α у мышей , трансплантированных TCF cKO (рис.4D) . Интересно, что такая же тенденция к снижению уровней у TCF-трансплантированных cKO мышей наблюдалась для IFN-γ в сыворотке (фиг. 4E-F) . Это предполагает, что Т-клетки TCF cKO CD8 могут быть способны продуцировать больше IFN-γ, чем клетки дикого типа при рестимуляции, но в действительности они продуцируют меньше IFN-γ, чем клетки дикого типа при аллотрансплантации. Мы также исследовали уровни IL-2 и обнаружили, что они были увеличены у мышей с трансплантированной TCF cKO на 7 день, поддерживая ранний рост пролиферации, но падая ниже уровней WT на 14 и 21 день, подтверждая гипотетическое снижение пролиферации по мере разрешения болезни. (рис.4G) .

CD8 Т-клетки в основном используют цитотоксические молекулы, такие как перфорин и гранизм В, для опосредования эффектов GVL (33). Мы изучили уровни перфорина и белка гранзима B, выполнив вестерн-блоттинг лизатов наивных CD8 T-клеток или аллотрансплантированных CD8 T-клеток от мышей WT и TCF cKO. Мы обнаружили, что наивные TCF cKO CD8 Т-клетки демонстрируют тенденцию к производству большего количества перфорина и гранзима B, чем WT CD8 T-клетки (рис. 4H-J) . Мы также обнаружили, что аллоактивированные TCF cKO CD8 Т-клетки все еще имеют тенденцию продуцировать больше гранзима B, чем WT CD8 T-клетки, с небольшой разницей в экспрессии перфорина по сравнению с WT (рис.4Н, К-Л) . Эти результаты предполагают, что эффект GVL поддерживается TCF cKO T-клетками, потому что они имеют большую экспрессию цитотоксических медиаторов, которые имеют решающее значение для этого процесса, на клеточную основу.

TCF-1 контролирует экспрессию хемокинов и хемокиновых рецепторов донорских CD8 Т-клеток во время аллоактивации

Одной из основных функций аллоактивированных Т-клеток является миграция из селезенки в органы-мишени РТПХ, включая печень и тонкий кишечник. Учитывая, что тяжесть РТПХ значительно снижается, когда донорские Т-клетки не имеют TCF-1, мы исследовали, имеют ли эти донорские клетки дефекты миграции в органы-мишени.Для этого мы аллотрансплантировали смертельно облученных мышей BALB / c, как описано выше, но с донорскими клетками, представляющими смесь 1: 1 CD3 + Т-клеток WT: TCF cKO (или WT: WT в качестве контроля). Всего было введено 1 × 10 ⁶ Т-клеток, и перед трансплантацией донорские клетки были проверены, чтобы гарантировать соотношение типов доноров 1: 1, а также для обеспечения приблизительно 1: 1 распределения CD4 и CD8 T. ячейки (рис. 5А) . Доноры WT Ly5.1 были идентифицированы с CD45.1, а доноры TCF cKO или WT C57 были идентифицированы с CD45.2. На 7 день селезенка, лимфатические узлы, тонкий кишечник и печень были удалены у мышей-реципиентов и исследованы на экспрессию h3Kb, CD45.1 и CD45.2 для определения относительной миграции донорских Т-клеток (фиг. 5A). ) .

Фигура 5: TCF-1 контролирует экспрессию хемокинов и хемокиновых рецепторов донорских CD8 Т-клеток во время аллоактивации.

Как и прежде, реципиентным мышам BALB / c аллотрансплантировали BALB / c BM и донорские CD3 Т-клетки от мышей WT и TCF cKO. Здесь 1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток представляли собой смесь WT (CD45.1): WT (CD45.2) или WT (CD45.1): TCF cKO (CD45.2) CD3 Т-клетки. (A) Перед трансплантацией образец донорских клеток проверяли, чтобы гарантировать соотношение CD4 и CD8 Т-клеток 1: 1 и соотношение донорских клеток CD45.1: CD45.2 1: 1. Через 7 дней после трансплантации у умерщвленных мышей-реципиентов брали печень, кишечник, селезенку и лимфатические узлы и обрабатывали для получения лимфоцитов. Лимфоциты окрашивали на h3Kb (донорские клетки), h3Kd (реципиентные клетки), CD3, CD4, CD8, CD45.1 и CD45.2. Здесь показаны графики потока до и после трансплантации от одного репрезентативного реципиента.Мышам (B-D) BALB / c аллотрансплантировали BM и 1 × 10 ⁶ донорских CD3 Т-клеток от мышей cKO WT или TCF (не смешанные). Донорские CD8 Т-клетки были отсортированы с помощью FACS из селезенки доноров до трансплантации и из селезенки и печени реципиентов на 7 день после трансплантации. Клетки сортировали в тризоле, затем экстрагировали РНК с использованием хлороформа и преобразовывали в кДНК для анализа кПЦР. кДНК запускали на предварительно изготовленных планшетах для анализа хемокинов / хемокиновых рецепторов мыши, и результаты отображались в виде тепловых карт.Справа показаны шкалы с кратным изменением для каждого гена по сравнению с контрольным геном 18S на каждом планшете. Белые прямоугольники с символом «X» представляют сигналы, слишком слабые для обнаружения или нечитаемые по иным причинам из-за технических ограничений / ошибок. (B) Т-клетки CD8 донора селезенки до трансплантации, (C) Т-клетки CD8 донора селезенки после трансплантации и (D) Т-клетки CD8 донора печени после трансплантации для WT по сравнению с донорами cKO TCF. N = 3 на группу для A с одним показанным репрезентативным экспериментом, N = 5 мышей в одном образце для каждого условия для B-D, показаны сводные данные .

Для CD8 T-клеток, TCF cKO-клетки присутствовали в кишечнике с несколько более низкой частотой, что указывает на потенциальный легкий дефект миграции (Рис. 5A) , (Supp. Fig. 2) . Однако это умеренное снижение донорских клеток TCF cKO также наблюдалось в селезенке, указывая на то, что либо очень легкий дефект миграции, либо, что более вероятно, умеренный дефект пролиферации, вызвал уменьшение (фиг. 5A), , (Supp., Фиг. 2) . Следовательно, потеря TCF-1, вероятно, не оказывает значительного влияния на миграцию аллаактивированных CD8 Т-клеток к органам-мишеням.

Дополнительная фигура 2: Потеря TCF-1 существенно не нарушает миграцию Т-клеток CD8, относящуюся к фигуре 5.

Мышей-реципиентов BALB / c аллотрансплантировали с BALB / c BM и смесью 1: 1 WT (CD45.1 ): WT (CD45.2) или WT (CD45.1): TCF cKO (CD45.2) донорские CD3 Т-клетки (всего 1 × 10 ⁶ клеток). Перед трансплантацией и на 7 день после трансплантации соотношение донорских клеток CD45.1 к CD45.2 оценивали с помощью проточной цитометрии. Образцы перед трансплантацией были взяты из клеток, подлежащих трансплантации, и образцы на 7-й день были получены из селезенки, лимфатических узлов, печени и тонкого кишечника реципиента.На графике нанесены отдельные точки со средним значением и стандартным отклонением. Данные были проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. N = 4-5 на группу (n = 1 для предварительной трансплантации), показан один репрезентативный эксперимент.

Экспрессия хемокинов и хемокиновых рецепторов является критическим аспектом миграции Т-клеток к органам-мишеням. Чтобы определить, влияет ли на экспрессию этих молекул потеря TCF-1 в CD8 T-клетках, мы с помощью FACS отсортировали до и после трансплантации донорские CD8 T-клетки от мышей WT или TCF cKO (селезенка только для предварительной трансплантации, селезенка или печень для посттрансплантации).Затем мы экстрагировали РНК из клеток, преобразовали ее в кДНК и выполнили КПЦР с использованием 96-луночного планшета с мышиными хемокинами / хемокиновыми рецепторами (Thermo Fisher). Как и ожидалось, экспрессия этих маркеров обычно повышалась в аллоактивированных клетках. Экспрессия этих маркеров была выше в TCF cKO CD8 T-клетках из селезенки до трансплантации по сравнению с WT до трансплантации селезенки (Рис. 5B) , но эти маркеры были подавлены в TCF cKO CD8 T-клетках из печени и селезенки после трансплантации. по сравнению с клетками WT (рис.5C-D) . Следовательно, TCF-1 контролирует экспрессию хемокиновых / хемокиновых рецепторов CD8 Т-клеток, но потеря этого фактора практически не влияет на миграцию этих клеток к органам-мишеням. Следует отметить, что миграционный дефект может становиться более очевидным по мере продолжения течения заболевания, учитывая, что GVHD разрешается со временем у мышей, которым трансплантировали TCF cKO.

TCF-1 контролирует пролиферацию, апоптоз и истощение зрелых аллоактивированных Т-лимфоцитов CD8

Для сохранения РТПХ донорские Т-клетки должны пролиферировать во вторичных лимфоидных органах и органах-мишенях (34, 35).Наивные и эффекторные Т-клетки вызывают РТПХ, но они недолговечны и должны быть заменены для поддержания аллоответа (35, 36). Учитывая, что количество клеток памяти увеличивается, а количество переходных / активирующих клеток уменьшается среди CD8 T-клеток, когда TCF-1 теряется, мы предположили, что пролиферация, выживаемость или истощение этих клеток также могут быть затронуты. Для исследования пролиферации этих клеток мышей BALB / c аллотрансплантировали, как описано выше, с мышами, получавшими 1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD3 (WT или TCF cKO) и 10 × 10 ⁶ ВМ-клеток BALB / c.Мышам-реципиентам давали 25 мг / кг EdU в PBS (внутрибрюшинная инъекция) на 5 и 6 день для мечения пролиферирующих клеток. На 7 день после трансплантации мы умерщвляли мышей-реципиентов и получали лимфоциты из селезенки и печени. Эти клетки окрашивали с помощью набора для химии EdU click (Invitrogen) для обнаружения окрашенных EdU (пролиферирующих) клеток с помощью проточной цитометрии. Наблюдалось увеличение пролиферации в селезенке и печени за счет CD8 TCF cKO T-клеток, что было значительным в печени (фиг. 6A-B) . Следовательно, на 7 день увеличивается пролиферация Т-клеток TCF cKO CD8.Мы также использовали окрашивание Ki67 в аналогичном, но отдельном эксперименте с алло-HSCT (без введения EdU), чтобы подтвердить эти результаты, поскольку Ki67 является маркером активации и пролиферации Т-клеток. Действительно, экспрессия Ki67 увеличивалась или имела тенденцию к увеличению для TCF cKO CD8 Т-клеток в селезенке и печени, соответственно (фиг. 6C-D) . Следовательно, пролиферация CD8 Т-клеток сразу после аллоактивации увеличивается за счет потери TCF-1. Однако, учитывая, что симптомы РТПХ исчезают через 7 дней у реципиентов , пересаженных TCF cKO (рис.1A) , мы предполагаем, что после этого момента пролиферация донорских клеток снижается ниже уровней WT.

Фигура 6: TCF-1 контролирует пролиферацию, апоптоз и истощение зрелых аллоактивированных Т-клеток CD8.

(A-B) Мышей BALB / c аллотрансплантировали, как и раньше, с BALB / c BM и WT или TCF cKO CD3 донорскими Т-клетками. Мышам-реципиентам вводили внутрибрюшинно. с 25 мг / кг EdU в PBS на 5 и 6 день после трансплантации. На 7 день у реципиентов удаляли селезенку и печень, обрабатывали для выделения лимфоцитов и окрашивали с помощью набора для химического окрашивания EdU click для обнаружения EdU.Клетки также окрашивали на CD3, CD4, CD8 и h3Kb для идентификации донорских клеток. (A) Процент донорских клеток, пролиферирующих с помощью EdU + в селезенке, и (B) в печени. (C-D) В аналогичном эксперименте лимфоциты селезенки и лимфоциты, полученные из печени аллотрансплантированных мышей-реципиентов, окрашивали на CD3, CD4, CD8, h3Kb и Ki67 для идентификации пролиферирующих / активированных Т-клеток. (C) Процент донорских клеток CD8, пролиферирующих Ki67 + в селезенке, и (D) в печени. (E-F) Мышам-реципиентам аллотрансплантировали, как и прежде, донорские CD3 Т-клетки BM и WT или TCF cKO. На 7 день отбирали селезенку и печень, обрабатывали для получения лимфоцитов и окрашивали на CD3, CD4, CD8 и h3Kb, а также с помощью аннексина V-FITC и LIVE / DEAD Near-IR. Клетки были разделены на три популяции: живые (Ann.V-NIR-), мертвые (Ann.V + NIR +) или апоптотические (Ann.V + NIR-). Это было сделано для селезенки (E), и (F), печени. (G-H) Как и раньше, мышей-реципиентов аллотрансплантировали, а на 7 день удаляли селезенку и печень и обрабатывали для получения лимфоцитов.Лимфоциты окрашивали на h3Kb, CD3, CD4, CD8 и TOX для идентификации истощенных клеток. Это было сделано для селезенки (G), и печени (H), . Все данные показаны в виде отдельных точек со средним значением и стандартным отклонением и были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента или двустороннего дисперсионного анализа (в зависимости от групп). * означает значение p ≤ 0,05, ** означает значение p ≤ 0,01, а *** означает значение p ≤ 0,001. N = 3-5 на группу с показанным одним репрезентативным экспериментом.

Нарушение выживаемости донорских Т-клеток после аллотрансплантации также может объяснить снижение заболеваемости.Чтобы проверить это, мы выполнили анализ смерти путем аллотрансплантации мышей-реципиентов, как описано, с 10 × 10 ⁶ BALB / c BM-клеток и 1 × 10 ⁶ донорских CD3 T-клеток (WT или TCF cKO). На 7 день после трансплантации мышей-реципиентов умерщвляли, мы получали клетки селезенки и печени и окрашивали их антителами против h3Kb, CD3, CD4 и CD8, а также к аннексину V-FITC и LIVE / DEAD Near-IR. . Это позволило нам идентифицировать донорские Т-клетки CD8 и далее разделить три отдельные популяции — живые клетки, мертвые клетки и апоптотические клетки (рис.6E-F). Когда мы сравнивали WT и TCF cKO донорские клетки в селезенке, мы обнаружили, что TCF cKO CD8 T-клетки имеют тенденцию к менее часто мертвым и более часто живым или апоптотическим, чем WT донорские клетки (Fig. 6E) . Оказалось, что не было разницы в апоптозе или гибели клеток в печени (фиг. 6F) . Это говорит о том, что CD8 T-клетки, лишенные TCF-1 в селезенке, могут быть более склонны к апоптозу после аллотрансплантации, предполагая аналогичную роль TCF-1 в выживании зрелых клеток, как и для развивающихся клеток в тимусе (37, 38).В подтверждение этого, когда мы попытались отсортировать CD8 Т-клетки от мышей с трансплантированными WT и TCF cKO на 7 день после трансплантации (в отдельном эксперименте), в селезенке от доноров TCF cKO было значительно меньше Т-клеток доноров CD8, чем от доноров WT (по количеству клеток / 10 000 отсортированных клеток) (дополнительная фиг. 3A) . Донорские клетки также имели тенденцию к снижению TCF cKO клеток в печени на 7 день (Supp. Fig. 3B) . Кроме того, мы попытались отсортировать CD8-клетки донора cKO TCF от мышей-реципиентов на 14-й день после трансплантации, и донорские клетки в селезенке и печени имели тенденцию к уменьшению по сравнению с T-клетками CD8 доноров cKO WT и TCF с 7-го дня (Supp .Рис. 3A-B) . Когда мы попытались культивировать TCF cKO T-клетки с использованием анти-CD3 / анти-CD28 с IL-2 или без него, мы обнаружили, что они плохо размножаются в культуре по сравнению с WT T-клетками даже при активации, что затрудняет работу in vitro ( эмпирические наблюдения). Следовательно, вероятно, что выживаемость и / или пролиферация уменьшаются после 7-го дня в TCF cKO CD8 T-клетках, что приводит к прогрессивному исчезновению симптомов, наблюдаемых у TCF-трансплантированных cKO мышей.

Дополнительный рисунок 3: Количество донорских Т-лимфоцитов CD8 уменьшается при потере TCF-1, как показано на рисунке 6.

Мышам-реципиентам аллотрансплантировали BALB / c BM и WT или TCF cKO CD3 донорские Т-клетки. Донорские CD8 Т-клетки были отсортированы с помощью FACS от доноров до трансплантации или от селезенки и печени реципиента через 7 дней после трансплантации. Только донорские клетки TCF cKO также были отсортированы на 14 день из селезенки и печени. Количество донорских клеток CD8 +, полученных путем сортировки на 10 000 отсортированных клеток, показано для селезенки (A), и печени (B), . Отдельные точки показаны со средним значением и стандартным отклонением, данные были проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа.** означает значение p ≤ 0,01, а *** означает значение p ≤ 0,001. N = 2-3 на группу (n = 1 для предварительной трансплантации), показан один репрезентативный эксперимент.

Наконец, также возможно, что донорские Т-клетки, лишенные TCF-1, истощаются вскоре после трансплантации. Чтобы определить, происходит ли это, мы аллотрансплантировали мышей-реципиентов, как описано, с 10 × 10 ⁶ BALB / c BM-клеток и 1 × 10 ⁶ донорских CD3 T-клеток (WT или TCF cKO). На 7 день после трансплантации мы окрашивали клетки селезенки и печени на TOX, маркер истощения Т-клеток.Мы обнаружили, что донорские CD8 Т-клетки от мышей TCF cKO были значительно более истощены в селезенке и имели тенденцию к большему истощению в печени, чем донорские клетки дикого типа (фиг. 6G-H) . В совокупности эти данные предполагают, что Т-клетки-доноры CD8 от мышей TCF cKO имеют более частый апоптоз, повышенное истощение и потенциальный прогрессирующий дефект пролиферации или выживаемости с течением времени по сравнению с Т-клетками CD8 дикого типа. Это обеспечивает клинически оптимальный фенотип, поскольку донорские клетки быстро уничтожают остаточные злокачественные клетки после трансплантации, но затем отмирают или становятся нефункциональными, устраняя угрозу повреждения ткани хозяина.Это наблюдение помогает объяснить, почему оценка GVHD уменьшается, а не сохраняется с течением времени для TCF cKO-трансплантированных мышей (рис. 1A) , поскольку донорские TCF cKO T-клетки могут больше не функционировать после 7-го дня.

Потеря TCF-1 изменяет супрессивный профиль Т-клеток

Чтобы определить, влияет ли потеря TCF-1 на супрессивный профиль донорских Т-клеток, 1 × 10 ⁶ Т-клетки WT или TCF cKO CD8 были аллотрансплантированы реципиентам BALB / c мышам с 10 × 10 ⁶ ВМ-клеток BALB / c, как описано.Лимфоциты выделяли из селезенки и печени мышей-реципиентов на 7, 14 и 21 день после трансплантации для фенотипирования. Мы исследовали экспрессию PD-1, PD-L1 и CTLA-4 (Supp. Fig. 4) . TCF cKO CD8 Т-клетки имели более низкую экспрессию PD-1 как в селезенке, так и в печени на 14 и 21 день после трансплантации, но не на 7 день после трансплантации (Supp. Рис. 4-A -B) . Эти данные предполагают, что CD8 Т-клетки от мышей TCF cKO могут быть менее восприимчивыми к подавлению опухолевыми клетками (или другими клетками), экспрессирующими PD-L1 (39–41).Следовательно, эти Т-клетки с большей вероятностью будут эффективны при уничтожении клеток-мишеней, потому что они менее способны отключаться при соответствующем ответе. Однако это фенотипическое изменение также увеличивает риск аутореактивного повреждения. Несмотря на это, оценка GVHD и гистологические срезы показывают снижение повреждения тканей у TCF cKO-трансплантированных мышей (Fig. 1A-E) .

Дополнительная фигура 4: Потеря TCF-1 изменяет профиль супрессии донорских Т-клеток CD8, связанный с фиг. 6.

реципиентных мышей BALB / c аллотрансплантировали BALB / c BM и WT или TCF cKO донорские Т-клетки CD8.На 7, 14 и 21 день после трансплантации селезенка и печень были взяты у реципиентов и обработаны для получения лимфоцитов. Лимфоциты окрашивали на CD3, CD4, CD8, h3Kb, PD-1, PD-L1 и CTLA-4. (A) Экспрессия PD-1 на донорных клетках CD8 + в селезенке с течением времени. (B) Экспрессия PD-1 на донорских клетках CD8 + в печени с течением времени. (C) Экспрессия PD-L1 на донорских клетках CD8 + в селезенке с течением времени. (D) Экспрессия PD-L1 на донорских клетках CD8 + в печени с течением времени. (E) Экспрессия CTLA-4 на донорских клетках CD8 + в селезенке с течением времени. (F) Экспрессия CTLA-4 на донорских клетках CD8 + в печени с течением времени. Показаны среднее значение и стандартное отклонение, данные были проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа, * означает значение p ≤ 0,05, *** означает значение p ≤ 0,001, а **** означает значение p ≤ 0,0001. N = 3-4 на группу и момент времени, показаны сводные данные одного эксперимента (проведенного один раз).

Экспрессия PD-L1 увеличивалась в селезенке только у мышей, получавших Т-клетки TCF cKO CD8, на 14 и 21 день после трансплантации (Supp.Рис. 4C-D) . Точная функция PD-L1, экспрессируемого на Т-клетках, неизвестна, но считается, что он способствует толерантности к опухоли, подавляя активацию и способствуя апоптозу других Т-клеток (42). Следовательно, более высокая экспрессия PD-L1 предполагает, что Т-клетки, которые не мигрируют в периферические ткани к более поздним временным точкам после трансплантации, способны подавлять другие Т-клетки вокруг них. Таким образом, потеря TCF-1 может индуцировать фенотип Т-клеток, который как менее подвержен внешнему подавлению, так и более способен подавлять другие Т-клетки.Это может привести к усиленному уничтожению опухолей с минимальным повреждением здоровых клеток-свидетелей.

На экспрессию CTLA-4 не влияла потеря TCF-1 в донорских Т-клетках CD8 как в печени, так и в селезенке (Supp. Рис. 4E-F) . CTLA-4 отвечает за выключение передачи сигналов активации в результате активации TCR (43). Следовательно, эти данные свидетельствуют о том, что клетки TCF cKO не страдают от аномального подавления или удлинения передачи сигналов TCR из-за неправильной регуляции. Эти клетки, скорее всего, не всегда «включены» или всегда «выключены» в отношении активации.

Пониженная экспрессия CXCR5 в CD8 T-клетках мышей с дефицитом TCF-1 может способствовать снижению тяжести GVHD

CXCR5 является основным хемокиновым рецептором Т-клеток, который способствует миграции T-клеток из селезенки, хотя CXCR5 традиционно описывается как T маркер подмножества фолликулярных клеток-помощников (Tfh). В ситуациях, когда антиген сохраняется в течение длительного периода времени, например, во время иммунизации или хронической вирусной инфекции, некоторые CD8 + Т-клетки также экспрессируют CXCR5. Эти клетки были описаны как стволовые и поддерживают пул истощенных CD8 + Т-клеток во время иммунного ответа в этих условиях (23).Эти клетки также ответственны за пролиферацию и ответ на блокаду PD-1 (44). При GVHD аллоантигены, которые распознаются донорскими Т-клетками, происходят из молекул HLA пациента, поэтому эти антигены присутствуют постоянно. Мы предположили, что стойкость повреждения GVHD с течением времени является результатом присутствия CXCR5 + CD8 + T-клеток, которые поддерживают пул клеток, способных реагировать на аллоантиген и вызывать повреждение. В этой модели CXCR5 + CD8 + T-клетки в селезенке непрерывно пролиферируют, позволяя волнам CD8 T-клеток мигрировать к органам-мишеням, постоянно вызывая повреждения.

Чтобы проверить, верна ли эта гипотеза, мы изучили экспрессию CXCR5 в наивных и аллоактивированных CD8 + Т-клетках дикого типа (рис. 7) . В наивных Т-клетках дикого типа экспрессия CXCR5 среди CD8 + Т-клеток была низкой — (фиг. 7A) — . После аллоактивации в течение 7, 14 или 21 дня у аллотрансплантированных мышей донорские CD8 + Т-клетки селезенки WT экспрессировали CXCR5 с большей частотой, чем наивные клетки (фиг. 7A-D) . Важно отметить, что эта экспрессия CXCR5 оставалась выше, чем наивные уровни во все моменты времени после аллоактивации, с пиком экспрессии примерно на 7 день (рис.7А-Г) . Кроме того, донорские CD8 + Т-клетки, обнаруженные в печени, также экспрессировали CXCR5 на низких уровнях, и эта экспрессия не изменялась с течением времени после аллоактивации (фиг. 7E-G) . Вместе эти данные подтверждают гипотезу о том, что у аллотрансплантированных мышей, получающих Т-клетки донора дикого типа, действительно существуют CXCR5 + CD8 + Т-клетки. Эти клетки сохраняются с течением времени и могут способствовать как продолжающемуся повреждению, так и постоянной миграции донорских клеток в печень и другие органы-мишени.

Рисунок 7: Снижение экспрессии CXCR5 в CD8 T-клетках мышей с дефицитом TCF-1 может способствовать снижению тяжести GVHD.

Реципиентным мышам BALB / c аллотрансплантировали BALB / c BM и WT или TCF cKO донорские Т-клетки CD8. Перед трансплантацией образец донорских клеток окрашивали на CXCR5. На 7, 14 и 21 день после трансплантации у мышей-реципиентов брали селезенку и печень, обрабатывали для получения лимфоцитов и окрашивали на CD3, CD4, CD8, h3Kb и CXCR5. (A) Экспрессия CXCR5 в селезенке в день 0 и с течением времени после трансплантации. (B-D) Экспрессия CXCR5 в каждый момент времени, (B) 7 дней, (C) 14 дней и (D) 21 день после трансплантации в селезенке. (E) Экспрессия CXCR5 в донорских клетках печени с течением времени после трансплантации. (F-G) Экспрессия CXCR5 на (F), день 14 и (G) день 21 после трансплантации в печени. N = 5-6 на группу и условие, со сводными данными (A, E) или отдельными точками (B-D, F-G) , показанными для одного эксперимента (выполненного один раз).

Предыдущие сообщения предполагают, что TCF-1 является единственным наиболее важным фактором транскрипции, ответственным за развитие этих Tfh-подобных CXCR5 + CD8 + Т-клеток (45).Поэтому мы исследовали, снижается ли экспрессия CXCR5, когда TCF-1 теряется в этих клетках. Частота CXCR5 + CD8 + Т-клеток не значительно ниже у наивных мышей TCF cKO, чем у наивных мышей WT (фиг. 7A) . Однако после аллоактивации CD8 + Т-клетки от мышей-доноров TCF cKO имели более низкую экспрессию CXCR5 в селезенке во все моменты времени, особенно на 14-й и 21-й день (фиг. 7A-D) . Хотя не сильно отличается от мышей WT, экспрессия CXCR5 среди CD8 + донорных Т-клеток от мышей TCF cKO также имеет тенденцию к снижению со временем в печени (рис.7E-G) , предполагая, что эти клетки не сохраняются или не заменяются последующими волнами мигрирующих клеток, когда TCF-дефицитные донорские клетки используются для трансплантации. Таким образом, эти данные подтверждают вывод, что TCF-1 действительно важен для развития CXCR5 + CD8 + T-клеток, но потеря TCF-1 только в T-клетках не отменяет полностью их развитие. Вместо этого частота этих клеток снижается в донорских клетках TCF cKO во время аллотрансплантации, что, как мы предполагаем, может приводить к нарушению миграции и, таким образом, к снижению устойчивости и тяжести повреждений, вызванных GVHD.

TCF-1 способствует контролю выживаемости клеток и иммунных сигнальных путей в донорских Т-клетках CD8

Учитывая, что фенотип и функции донорских Т-клеток, а также исходы заболевания были значительно изменены из-за потери TCF-1 у донора клеток, мы стремились определить, какие именно генные изменения произошли, чтобы поддержать это. Мы аллотрансплантировали реципиентным мышам BALB / c 10 × 10 ⁶ BALB / c BM и 1 × 10 ⁶ Т-лимфоцитов CD3, как указано выше, и отсортированные по FACS до и после трансплантации Т-клетки WT или TCF cKO донорские CD8. , которые хранились в Тризоле.Затем было выполнено секвенирование РНК (подготовлено SUNY Upstate Molecular Analysis Core, секвенирование University at Buffalo Genomics Core). Данные были проанализированы в Partek Flow (рис. 8) . Мы обнаружили, что WT и TCF донорские CD8 Т-клетки cKO группируются вместе как по штамму, так и по времени (до и после трансплантации) (Рис. 8A) . (Дополнение Рис. 5A-C) . На многие гены повлияла потеря TCF-1 в донорских клетках после трансплантации, при этом были затронуты клетки как в селезенке, так и в печени (рис.8Б) . Изменения Tbx21 (T-bet), а также Cxcr4 и Ccr4 (хемокиновые рецепторы) наблюдались в донорских Т-клетках CD8 перед трансплантацией, лишенных TCF-1 (Supp. Fig. 5D) . Как и раньше, значимые гены определяли по значению p ≤ 0,05 для клеток до трансплантации. В селезенке после трансплантации изменения в IFNg (IFN-γ), Tbx21 (T-bet), Prf1 (перфорин) и Il2rb (CD122) наблюдались для TCF cKO cD8 T-клеток (фиг. 8C) . В печени донорные Т-клетки CD8 с дефицитом TCF-1 показали изменения в IFN-γ и Cxcr6 (хемокиновый рецептор) (рис.8D) . Эти данные подтверждают наши более ранние открытия, что экспрессия хемокинов / хемокиновых рецепторов, а также цитокинов и цитотоксических медиаторов регулируется TCF-1 в зрелых аллоактивированных Т-клетках CD8.

Дополнительная фигура 5: образцы донорских CD8 Т-клеток группируются по штамму, и TCF-1 изменяет экспрессию гена до трансплантации, относящуюся к фигуре 8.

Что касается фиг. 8, мышей-реципиентов аллотрансплантировали BM и донорские CD3 cKO WT или TCF. Т-клетки. Донорские клетки до и на 7 день после трансплантации были отсортированы с помощью FACS из селезенки донора или селезенки / печени реципиента, соответственно.Секвенирование РНК проводили на донорских клетках, как показано на рис. 8. (AC) Иерархическая кластеризация выполнялась для (A), селезенки до трансплантации, (B), селезенки после трансплантации и (C), после трансплантации. -пересадка образцов печени. (D) Тепловая карта, показывающая избранные значительно измененные гены в донорских CD8 Т-клетках из предтрансплантационной селезенки. (E) Анализ пути проводился на образцах Т-клеток донора CD8 из селезенки перед трансплантацией. Дифференциально экспрессируемые гены для D-E были идентифицированы по значению p ≤ 0.05 (а не FDR ≤ 0,05) и кратное изменение ≥ 2 или ≤ −2. N = 3 на группу и условие, показан один эксперимент (проведенный один раз).

Фигура 8: TCF-1 способствует контролю выживаемости клеток и иммунных сигнальных путей в донорских Т-клетках CD8.

Для выполнения секвенирования РНК реципиентам BALB / c аллотрансплантировали BALB / c BM и WT или TCF cKO CD3 Т-клетки. Перед трансплантацией донорские клетки CD8 + были отсортированы с помощью FACS для получения образца для секвенирования. На 7 день после трансплантации донорские CD8 Т-клетки были отсортированы с помощью FACS обратно из селезенки и печени мышей-реципиентов.Клетки помещали в Trizol, затем экстрагировали РНК и проводили секвенирование парных концов. (A) Анализ PCA, показывающий кластеризацию донорских Т-клеток CD8 по штамму и по временным точкам (до и после трансплантации). Точки окрашены по деформации и сгруппированы по времени. (B) Диаграмма Венна, показывающая количество дифференциально экспрессируемых генов, обнаруженных в селезенке и печени после трансплантации для WT по сравнению с TCF cKO CD8 донорскими Т-клетками. В качестве критериев отбора использовались FDR ≤ 0,05 и кратное изменение ≥ 2 или ≤ −2. (C-D) Тепловая карта, показывающая избранные значительно измененные гены в донорских CD8 T-клетках из (C), после трансплантации селезенки или (D) после трансплантации печени. (E-F) Анализ обогащения путей с выбранными обогащенными путями, показанными для (E), после трансплантации печени и (F) после трансплантации селезенки. Все показанные пути имеют значение p ≥ 0,05, а цвет заливки указывает значение p. (G) Уровень экспрессии CXCR5 в счетах на миллион считываний для WT по сравнению с Т-клетками CD8 донора cKO TCF после трансплантации в селезенке и печени.Показаны отдельные образцы с диаграммой, показывающей сводную статистику. По оси ординат используется логарифмическая шкала. N = 3-5 образцов на группу и условие, показан один эксперимент (проведенный один раз).

Анализ обогащения пути в донорских клетках CD8 перед трансплантацией показал, что потеря TCF-1 влияет на дифференцировку Т-клеток, клеточную адгезию, многие пути передачи сигналов (MAPK, NFκB, кальций и другие) и передачу сигналов TCR (рис. 5E) . Этот анализ проводился с использованием p-значений, а не с использованием частоты ложных обнаружений (FDR), поскольку при FDR ≤0 не было обнаружено значительных отличий друг от друга.05. После трансплантации многие пути были затронуты потерей TCF-1 как в селезенке, так и в донорских Т-клетках CD8, полученных из печени. В обоих органах потеря TCF-1 влияет на клеточный цикл, некроптоз, клеточное старение и пути аутофагии (Fig. 8E-F) . Это подтверждает идею о том, что CD8 Т-клетки более склонны к апоптозу или другим формам гибели клеток при потере TCF-1, что приводит к потере донорских клеток после аллотрансплантации. В печени также были затронуты NOD- и TCR-сигналы, тогда как в селезенке были затронуты метаболизм, репликация ДНК, дифференцировка Т-клеток, передача сигналов NFκB и TNF (рис.8E-F) .

Наконец, мы изучили уровни экспрессии CXCR5 в посттрансплантационных донорских CD8 Т-клетках селезенки и печени, сравнивая образцы cKO WT и TCF. Мы обнаружили, что уровень экспрессии CXCR5 имеет тенденцию к снижению в донорских клетках TCF cKO на D7 (Fig. 8G) , подтверждая результаты, которые мы получили с помощью проточной цитометрии (Fig. 7) . Хотя CXCR5 не был идентифицирован как значительно измененный ген (селезенка d7 имела p-значение 0,041, но FDR 0,114, d7 печень имела p-значение 0.074 и FDR 0,179), изменение кратности для этого гена было относительно большим в селезенке (8,392), что согласуется с нашими данными проточной цитометрии. Следовательно, вероятно, что потеря CXCR5 в CD8 Т-клетках является важным фактором снижения GVHD, наблюдаемого от донорских клеток с дефицитом TCF. В целом, эти результаты показывают, что TCF-1 контролирует широкий спектр иммунных генных программ в зрелых и аллаактивированных Т-клетках CD8. Потеря TCF-1 в донорских клетках приводит к благоприятному фенотипу после аллотрансплантации, в первую очередь за счет изменения экспрессии генов, что приводит к изменению функции Т-клеток.

Обсуждение

В этой рукописи, а также в нашей сопутствующей рукописи мы определили Т-клеточный фактор-1 (TCF-1) как критический регуляторный фактор транскрипции для аллоактивированных зрелых Т-клеток. TCF-1, как известно, важен для развития Т-клеток, а также для активации в некоторых случаях (46) (47). Однако ранее было неизвестно, играет ли TCF-1 роль в регуляции зрелых и аллоактивированных Т-клеток. Здесь мы показываем, что потеря TCF-1 отделяет GVHD от GVL, управляемую CD8 T-клетками, клинически оптимальным образом.Хотя TCF-1 в донорских Т-клетках незаменим для эффектов GVL, он важен для повреждения тканей хозяина во время GVHD. Важно отметить, что мы показываем здесь и в нашей сопутствующей рукописи, что роль TCF-1 в регуляции этих Т-клеток уникальна для CD8 по сравнению с Т-клетками CD4.

Используя нашу уникальную модель мыши с Т-клеточной делецией TCF-1, а не с глобальным дефицитом, мы смогли изучить зрелые CD8 Т-клетки на модели алло-HSCT. Эта модель на мышах позволяет нам изучать функцию Т-клеток, клинические исходы и экспрессию генов в одной модели.Здесь мы показали, что TCF-1-дефицитные донорские CD8 Т-клетки вызывают менее тяжелую и стойкую GVHD, чем WT CD8 T-клетки. Кроме того, повреждение тканей печени, кожи и тонкого кишечника (всех органов-мишеней) было уменьшено за счет потери TCF-1 донорскими Т-клетками CD8. Это показывает, что TCF-1 в донорских Т-клетках необходим для повреждения и сохранения РТПХ с течением времени. Важно отметить, что эффекты GVL не были нарушены потерей TCF-1, что позволяет предположить, что TCF-1 незаменим для эффектов GVL. Это было наиболее вероятно из-за увеличения количества перфорина и гранзима B перед трансплантацией, а также увеличения количества гранзима B после трансплантации для TCF-1-дефицитных CD8 T-клеток.Повышенная экспрессия Eomes и T-bet также может способствовать эффектам GVL (10, 16) (48). Это говорит о том, что, несмотря на другие функциональные изменения, которые нарушают повреждение GVHD, увеличение цитотоксических медиаторов помогает поддерживать эффекты GVL, управляемые TCF cKO CD8 T-клетками.

Мы также исследовали основные функции аллоактивированных Т-клеток — миграцию, пролиферацию и производство цитокинов — чтобы лучше понять, как TCF-1 регулирует зрелые Т-клетки для обеспечения оптимального фенотипа заболевания. Мы показали, что потеря TCF-1 в донорских Т-клетках CD8 приводит к снижению продукции TNF-α (но при этом к увеличению продукции IFN-γ), повышенной предрасположенности к апоптозу, усилению истощения и, возможно, снижению пролиферации аллоактивированных донорских Т-клеток.Снижение выживаемости и продукции TNF-α донорскими Т-клетками CD8 приводит к снижению тяжести РТПХ. Однако экспрессия перфорина и Granyzme B была увеличена, что позволяет этим клеткам поддерживать эффекты GVL, несмотря на их функциональные недостатки. Кроме того, хотя серьезных миграционных дефектов обнаружено не было, потеря TCF-1 изменяла экспрессию хемокинов и хемокиновых рецепторов на донорских Т-клетках CD8 как до, так и после трансплантации. Этот фенотип, вызванный потерей TCF-1, является клинически оптимальным, поскольку он позволяет очищать остаточные злокачественные клетки, ограничивая при этом риск опасного для жизни повреждения GVHD.

Когда мы попытались отсортировать с помощью FACS донорские Т-клетки от реципиентов на 7-й день, мы обнаружили, что количество донорских клеток для мышей, трансплантированных TCF cKO, было значительно снижено в селезенке и имеет тенденцию к уменьшению в печени. Выживание Т-клеток должно происходить для сохранения ответов GVHD (36). Эти данные подтверждают идею о том, что донорские клетки с дефицитом TCF-1 либо умирают, либо не пролиферируют после трансплантации, что коррелирует с наблюдаемым увеличением количества апоптотических клеток, а также со снижением тяжести заболевания после 7-го дня после трансплантации.Это наблюдение в сочетании с увеличением истощения донорских CD8 Т-клеток TCF cKO позволяет предположить, что донорские клетки, лишенные TCF-1, сильно активированы и цитотоксичны для злокачественных клеток на раннем этапе после трансплантации, но быстро умирают или истощаются, ограничивая прогрессирование РТПХ. Это также имеет смысл, учитывая наблюдение, что пролиферация клеток TCF cKO на 7 день выше, поскольку мы ожидаем, что эти клетки функционируют нормально или даже лучше, чем клетки WT, но затем быстро теряют функциональность и отмирают.Опять же, это критически важно, поскольку потеря TCF-1 позволяет очищать опухолевые клетки за счет эффектов GVL, но после этого момента донорские клетки больше не вызывают повреждения GVHD, быстро излечивая болезнь и с меньшим повреждением тканей.

Когда мы фенотипировали TCF cKO и WT CD8 Т-клетки перед трансплантацией, мы обнаружили рост активированных клеток (CD122 +, CD44 +), а также увеличение экспрессии Eomes и T-bet. Eomes и T-bet связаны с экспрессией цитотоксических медиаторов, таких как перфорин (Eomes) и IFN-γ (T-bet) (49, 50).Кроме того, мы обнаружили, что Т-клетки центральной памяти CD8 были увеличены у мышей TCF cKO. В то время как эффекторные и наивные клетки, как известно, вызывают тяжелую GVHD, клетки памяти часто связаны с менее тяжелым заболеванием (10, 32), предполагая, что это фенотипическое изменение в клетках TCF cKO может быть полезным для снижения тяжести заболевания. Эти фенотипические эффекты были в основном присущи клеткам и обусловлены потерей TCF-1. Мы также обнаружили, что профиль подавления Т-лимфоцитов CD8 изменяется из-за потери TCF-1. Экспрессия PD-1 была снижена, а экспрессия PD-L1 увеличена на Т-клетках донора TCF cKO CD8 поздно после трансплантации (дни 14 и 21).Это говорит о том, что донорские клетки могут быть менее восприимчивы к подавлению клетками PD-L1 + (такими как опухолевые клетки) и могут быть более способны подавлять другие близлежащие клетки (26, 51). Это может позволить донорским Т-клеткам, лишенным TCF-1, атаковать опухолевые клетки, но также подавить аллоактивированные соседние донорские клетки, чтобы ограничить болезнь.

Недавняя работа идентифицировала субпопуляцию CXCR5 + CD8 Т-клеток, которая возникает после хронической стимуляции антигеном. Эти клетки похожи на стволовые и, как считается, поддерживают пул реагирующих CD8 Т-клеток во время хронических иммунных ответов (22, 23).Учитывая, что аллоантиген постоянно присутствует во время GVHD, мы стремились определить, существует ли эта субпопуляция клеток также при GVHD, и может ли она способствовать тяжести заболевания. Действительно, мы обнаружили, что Т-клетки, полученные от донора CXCR5 + CD8 +, обнаруживаются у мышей, аллотрансплантированных с донорскими Т-клетками дикого типа. У этих мышей развивается тяжелая РТПХ, и они плохо выживают. Интересно, что пик этих клеток, по-видимому, приходится на 7-й день, который обычно является пиком тяжести заболевания по клиническим оценкам. Мы также обнаружили, что частота этих CXCR5 + CD8 + донорных Т-клеток снижена у мышей, аллотрансплантированных донорскими клетками TCF cKO.Считается, что TCF-1 является критическим фактором для продукции этих клеток (52), однако модуляция TCF-1 в Т-клетках CD8 только снижает частоту этих клеток. Важно отметить, что это снижение CXCR5 + CD8 + T-клеток коррелировало с паттерном снижения тяжести заболевания и устойчивости у мышей, которым трансплантировали TCF cKO. Результаты RNAseq для посттрансплантационных клеток D7 в селезенке и печени демонстрируют ту же тенденцию, при этом уровень экспрессии CXCR5 имеет тенденцию к снижению в Т-клетках CD8 доноров TCF cKO. Это говорит о том, что CXCR5 + CD8 + Т-клетки могут быть ответственны за управление хроническими ответами на аллоантиген во время GVHD, и что истощение этого подмножества может предотвращать или уменьшать тяжесть и постоянство GVHD.Критически важно, что эффекты GVL сохранялись, несмотря на снижение частоты этих клеток от доноров TCF cKO, что позволяет предположить, что CXCR5 + CD8 + T-клетки могут быть важны для GVHD, но не эффекты GVL. Дальнейшая модуляция или истощение этого подмножества клеток может, следовательно, потенциально отделить GVHD от эффектов GVL.

Наконец, чтобы идентифицировать изменения в генетической программе донорских Т-клеток, которые произошли в отсутствие TCF-1, мы выполнили секвенирование РНК на донорских Т-клетках до и после трансплантации.Мы обнаружили, что донорские Т-клетки CD8 сгруппированы вместе как по штамму, так и по времени (до и после трансплантации), и что многие гены были изменены из-за дефицита TCF-1. При сравнении донорских клеток до трансплантации ни один гены не выявили значительных различий при использовании FDR ≤0,05, что, скорее всего, означает, что донорские клетки от мышей WT и TCF cKO схожи до трансплантации. Следовательно, значение p ≤ 0,05 использовалось для определения значимых генов для анализа путей (только для предварительной трансплантации). Это также предполагает, что изменения экспрессии Eomes и T-bet, наблюдаемые при фенотипировании, были обусловлены посттранскрипционными изменениями.В предтрансплантационных клетках дефицит TCF-1 привел к изменениям клеточной адгезии, TCR и других сигнальных путей, а также к дифференцировке Т-клеток, среди прочего. Следует отметить, что донорские клетки после трансплантации как селезенки, так и печени показали изменения в путях некроптоза, клеточного цикла, аутофагии и клеточного старения. Это убедительно подтверждает наши ex vivo доказательства того, что донорские Т-клетки TCF cKO CD8 более склонны к апоптозу и поэтому, скорее всего, отмирают после аллотрансплантации, позволяя болезни исчезнуть.Кроме того, потеря TCF-1 влияет на множественные иммунные сигнальные пути, такие как NOD, NFκB и TNF. Следовательно, TCF-1 контролирует эти связанные с иммунитетом генетические программы в зрелых и аллаактивированных Т-клетках CD8.

В нашей сопутствующей рукописи мы также обращаемся к роли TCF-1 в регуляции аллоактивированных Т-лимфоцитов CD4. Из этой работы мы обнаружили, что регуляция CD4 по сравнению с CD8 Т-клетками с помощью TCF-1 отличается, скорее всего, из-за способности TCF-1 поддерживать идентичность клонов и изменять экспрессию генов в этих подмножествах.В целом, наши данные показывают, что TCF-1 играет прямую роль в регуляции зрелых CD4 и CD8 Т-клеток во время аллоактивации. Потеря TCF-1 в Т-лимфоцитах CD8 (а также Т-лимфоцитах CD4) приводит к снижению тяжести и устойчивости GVHD, но поддерживает эффекты GVL, управляемые Т-лимфоцитами CD8. Это может быть связано, по крайней мере, частично с уменьшением количества Т-клеток, полученных от донора CXCR5 + CD8 +, которые во времени коррелируют с пиком тяжести заболевания. Следовательно, модуляция TCF-1 и, возможно, T-клеток CXCR5 + CD8 может отделять GVHD от GVL для обеспечения клинической пользы для пациентов с алло-HSCT или при лечении других заболеваний, опосредованных T-клетками.

Материалы и методы

Мышиные модели

Для трансплантации использовали следующих самок мышей-доноров: B6-Ly5.1 (CD45.1 +, «WT» или B6.SJL-Ptprca Pepcb / BoyCrl, 494 из Charles River ), C57Bl / 6J (CD45.2 +, «WT», 000664 от Jackson Laboratories), Tcf7 flox x CD4cre (далее «TCF cKO» (17), полученный от доктора Джоти Мисра Сена из NIH с разрешения Доктора Ховарда Сюэ, собственного разведения) или CD4cre (022071 от Jackson Laboratories, собственного разведения). Эти мыши-доноры были максимально сопоставимы по возрасту друг с другом и с реципиентами.Самок мышей BALB / c (CR: 028 от Charles River, возраст 8 недель и старше) использовали в качестве мышей-реципиентов для экспериментов по трансплантации, а мышей Thy1.1 (B6.PL-Thy1a / CyJ, 000406 от Jackson Labs) использовали в качестве мышей-реципиентов для экспериментов с химерой.

Модели аллотрансплантата и опухоли

Мышей-реципиентов BALB / c облучали двумя дозами рентгеновских лучей по 400 сГр (общая доза 800 сГр) и отдыхали не менее 12 часов между дозами. Перед трансплантацией мышей также отдыхали в течение 4 часов. Т-клетки (общий CD3 + или CD8 +) отделяли от селезенки WT, CD4cre или TCF cKO с использованием CD90.2 или микрогранулы CD8 и колонки LS (Miltenyi, CD8: 130-117-044, CD90.2: 130-121-278, LS: 130-042-401). 1 × 10 ⁶ донорских клеток вводили внутривенно в хвостовую вену в PBS вместе с 10 × 10 ⁶ клеток костного мозга BALB / c. Костный мозг истощали Т-клетками с помощью бусинок CD90.2 MACS (130-121-278 от Miltenyi) и колонок LD (130-042-901 от Miltenyi). Для краткосрочных экспериментов на 7 день после трансплантации мышей-реципиентов умерщвляли и собирали сыворотку, селезенку, лимфатические узлы, тонкий кишечник или печень, в зависимости от эксперимента.Для анализа миграции использовали соотношение 1: 1 WT (CD45.1): WT (CD45.2) или WT (CD45.1): TCF cKO (CD45.2), чтобы получить 1 × 10 ^{клеток-доноров. 6} Т-клеток. Для экспериментов с GVHD и GVL мышам-реципиентам также давали 2 × 10 ⁶ B-клеточных опухолевых клеток острого лимфобластного лейкоза (B-ALL), экспрессирующих люциферазу (10, 27). Мышей-реципиентов взвешивали, выставляли клиническую оценку и снимали изображения с помощью системы визуализации IVIS 200 три раза в неделю до 60-го дня или дольше. Клинические оценки состояли из оценок целостности кожи, текстуры шерсти, осанки, активности, диареи и потери веса.Визуализация была сделана путем инъекции реципиентам внутрибрюшинно. с D-люциферином для обнаружения биолюминесценции опухолевых клеток. Для получения смешанных химер костного мозга мышей Thy1.1 смертельно облучали и восстанавливали смесью 1: 4 (WT: TCF cKO) клеток костного мозга (всего 50 × 10 ⁶ клеток), затем отдыхали в течение 9 недель. Через 9 недель кровь из хвостовой вены собирали и проверяли проточной цитометрией на CD45.1 и CD45.2, чтобы гарантировать восстановление донорскими клетками обоих типов. Через 10 недель мышей использовали для экспериментов по фенотипированию.

Проточная цитометрия, сортировка и фенотипирование

Спленоциты (или клетки из других органов) были получены от мышей WT или TCF cKO или мышей-реципиентов с аллотрансплантацией. Были получены лимфоциты и лизированы буфером для лизиса эритроцитов (00-4333-57 от eBioscience) для удаления красных кровяных телец, если это необходимо. Затем клетки окрашивали внеклеточными маркерами в течение 30 минут на льду в буфере MACS (1X PBS с EDTA и 4 г / л BSA). Если использовались внутриклеточные маркеры, клетки затем фиксировали и повышали проницаемость с использованием Fix / Perm Concentrate and Fixation Diluent из набора буферов для окрашивания фактора транскрипции FOXP3 (eBioscience cat.№ 00-5523-00). Затем клетки обрабатывали на цитометре BD LSR Fortessa и данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo v9 (Treestar). Все антитела использовали в разведении 1: 100. Для FACS-сортировки применялись те же методы, и клетки обрабатывались на BD FACS Aria IIIu с блоками холодной сортировки. Клетки сортировали по средам для сортировки (50% FBS в RPMI) или тризолу, в зависимости от эксперимента.

В зависимости от эксперимента использовались антитела: анти-CD4 (FITC, PE, BV785, BV21), анти-CD8 (FITC, PE, APC, PerCP, Pacific Blue, PE / Cy7), анти-CD3 (BV605 или APC / Cy7), анти-h3Kb-Pacific Blue, анти-h3Kd-PE / Cy7, анти-CD122 (FITC или APC), анти-CD44 (APC или Pacific Blue), анти-CD62L (APC / Cy7), анти- TNF-α-FITC, анти-IFN-γ-APC, анти-Eomes (AF488 или PE / Cy7), анти-T-bet-BV421, анти-CD45.2-PE / Dazzle594, анти-CD45.1-APC, анти-Ki67 (PE или BV421), анти-PD-1-BV785, анти-CTLA-4-PE и анти-PD-L1 (PE или PE / Dazzle594), анти-аннексин V-FITC, LIVE / DEAD Near IR, anti-EdU-AF647 (набор для химии щелчков), anti-TOX-APC и анти-CXCR5-APC.

Гистология

Мышей-реципиентов аллотрансплантировали, как описано, и органы удаляли для гистологии на 7-й, 14-й и 21-й день после трансплантации. Селезенку, печень, тонкий кишечник и кожу (от уха и спины) фиксировали, делали на срезы и окрашивали H&E в Корнельском университете (https: // www.vet.cornell.edu/animal-health-diagnostic-center/laboratories/anatomic-pathology/services). Патолог (AM), который не смог определить идентичность слайда и условия исследования, затем оценил разделы на предмет повреждения РТПХ по шкале от 0 до 4. Критерии: для кожи — базальная вакуолизация клеток до явной денудации эпидермиса, для тонкой кишки — некроз отдельных клеток до диффузной денудации слизистой оболочки и для печени — процент желчных протоков с повреждением эпителия (I ≤ 25%, II 25-49%). , III 50-74%, IV 75-100%). (53) (54).

Выделение лимфоцитов из печени, тонкой кишки или лимфатических узлов

Печень перфузировали 5-10 мл ледяного PBS для удаления эритроцитов, затем пропускали через фильтр 70 мкм с PBS. Клетки центрифугировали для удаления обломков, а затем центрифугировали в течение 22 минут в 40% перколле в RPMI / PBS (22 ° C, 2200 об / мин, без торможения, без ускорения) для выделения лимфоцитов. Затем использовали буфер для лизиса эритроцитов для удаления любых оставшихся эритроцитов, и клетки помещали в буфер MACS (BSA в PBS). Для получения лимфоцитов из кишечника тонкий кишечник удаляли в ледяной буфер MACS, разрезали и промывали MACS.Стрип-буфер (1XPBS, FBS, EDTA 0,5M и DTT 1M) использовали для удаления эпителия (встряхивание в течение 30 минут при 37 ° C) с последующим измельчением и инкубацией с буфером для расщепления (коллагеназа, ДНКаза и RPMI) в течение 30 минут при 37 С (при встряхивании). Кусочки кишечника встряхивали и протирали через фильтр 70 мкм с жидкостью для получения суспензии клеток. Перколл использовали как печень для выделения лимфоцитов из этой суспензии, но лизис эритроцитов не проводили. Для лимфатических узлов паховые, плечевые и подмышечные лимфатические узлы были взяты у реципиентов и измельчены между предметными стеклами.Клетки промывали в пробирке с MACS и центрифугировали для удаления остатков.

Рестимуляция цитокинов

Мышам-реципиентам BALB / c аллотрансплантировали 1,5 × 10 ⁶ CD3 донорских Т-клеток и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM и подвергали эвтаназии на 7 день. Спленоциты отбирали и культивировали в течение 6 часов. с GolgiPlug (1: 1000) и PBS (контроль) или анти-CD3 (1 мкг / мл) / анти-CD28 (2 мкг / мл) (стимуляция TCR) при 37 ° C и 7% CO2. После 6 часов культивирования клетки окрашивали на CD3, CD4, CD8, h3Kb, TNF-α и IFN-γ с использованием набора для окрашивания цитокинов BD (BD Biosciences, 555028) и запускали на проточном цитометре.

LegendPLEX Serum ELISA Assay

Сыворотка из сердечной крови была собрана у мышей-реципиентов в эксперименте по рестимуляции цитокинов. Сыворотку анализировали с использованием набора Biolegend LEGENDPlex Assay Mouse Th Cytokine Panel (741043). Этот набор количественно определяет сывороточные концентрации: ИЛ-2 (пролиферация Т-клеток), ИФН-у и ФНО-а (клетки Th2, воспалительные), ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13 (клетки Th3), ИЛ-10. (Treg-клетки, супрессивные), IL-17A / F (клетки Th27), IL-21 (клетки Tfh), IL-22 (клетки Th32), IL-6 (острое / хроническое воспаление / фактор выживания T-клеток) и IL -9 (Th3, Th27, iTreg, Th9 — кожное / аллергическое / кишечное воспаление).

Вестерн-блоттинг

Спленоцитов от мышей-доноров cKO WT или TCF или от мышей-реципиентов с трансплантированными WT или TCF cKO, как описано (1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD8 и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM ), были собраны. CD8 + Т-клетки разделяли с использованием гранул CD8 MACS. Эти клетки подсчитывали и лизировали буфером RIPA (89900 от Thermo Fisher) плюс ингибиторы протеаз (11697498001 от Millipore Sigma) для получения лизатов. Лизаты обрабатывали методом вестерн-блоттинга и анализировали на перфорин, гранзим B и актин.

Анализ миграции

Реципиентных мышей BALB / c аллотрансплантировали, как и раньше, с 10 × 10 ⁶ BALB / c BM и 1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD3. Однако 1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток представляли собой смесь 1: 1 Т-клеток WT CD45.1 + CD3 либо с клетками WT CD45.2 +, либо с клетками TCF cKO CD45.2 +. Перед трансплантацией донорские клетки проверяли, чтобы гарантировать 1: 1 CD4 / CD8 T-клеток и донорского штамма (WT: WT или WT: TCF cKO). Через 7 дней после трансплантации реципиентов умерщвляли и удаляли селезенку, лимфатические узлы, печень и тонкий кишечник.Лимфоциты получали из органов, как описано, и окрашивали на CD3, CD4, CD8, h3Kb, h3Kd, CD45.1 и CD45.2. Отношение клеток CD45.1 к CD45.2 определяли по данным проточной цитометрии (т.е. WT к WT или WT к TCF cKO).

Анализ кПЦР

Для проведения кПЦР мышей BALB / c аллотрансплантировали, как описано (1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD3 и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM). Донорские клетки перед трансплантацией и клетки селезенки и печени после трансплантации (день 7) от реципиентов были отсортированы с помощью FACS для получения донорских клеток CD8 +.Клетки сортировали в Trizol, РНК экстрагировали с использованием хлороформа (https://www.nationwidechildrens.org/Document/Get/93327) и элюировали с помощью Qiagen RNEasy Minikit (74104 от Qiagen). Концентрацию проверяли с помощью спектрофотометра, затем РНК превращали в кДНК с помощью набора Invitrogen Super Script IV First Strand Synthesis System (180 от Invitrogen). Конечную концентрацию кДНК проверяли с помощью спектрофотометра, затем кДНК смешивали с Taqman Fast Advanced Master Mix (4444557 от Invitrogen) при концентрации кДНК 10 нг / мкл.Эту мастер-смесь добавляли в предварительно приготовленные 96-луночные планшеты TaqMan Array с праймерами хемокинов / хемокиновых рецепторов (Thermo Fisher, Mouse Chemokines & Receptors Array, планшет, 4391524). qPCR выполняли в термоциклере Quant Studio 3, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Design and Analysis v2.4 (предоставленного Thermo Fisher). Пять отдельных мышей-реципиентов были отсортированы, и клетки были объединены для получения одного образца для количественной ПЦР для каждого состояния / органа.

Анализ пролиферации

Реципиентных мышей BALB / c аллотрансплантировали, как и раньше (1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD3 и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM).На 5-й и 6-й день после трансплантации мышам-реципиентам вводили внутрибрюшинную инъекцию. с 25 мг / кг EdU в PBS. На 7 день мышей-реципиентов умерщвляли, а селезенку и печень обрабатывали для получения лимфоцитов. Набор для химии EdU click (C10424 от Invitrogen) использовался вместе с антителами к CD3, CD4, CD8 и h3Kb для обнаружения пролиферирующих донорских клеток. In vitro попыток культивирования, упомянутых в качестве эмпирических наблюдений, были выполнены при 37 ° C, 7% CO2, с анти-CD3 (1 мкг / мл), анти-CD28 (2 мкг / мл) и в некоторых случаях с IL-2 (1000 МЕ / мл). мл).

Анализ смерти

Для оценки апоптоза и гибели донорских клеток мышей-реципиентов аллотрансплантировали, как указано выше (1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD3 и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM). Через 7 дней после трансплантации мышей-реципиентов умерщвляли и отбирали селезенку и печень. Лимфоциты получали, как описано, и окрашивали антителами к CD3, CD4, CD8 и h3Kb для идентификации донорских клеток. Клетки также окрашивали аннексином V-FITC (V13242 от Invitrogen) и LIVE / DEAD Near IR (L34976 от Invitrogen).Аннексин V и NIR использовали для идентификации мертвых (Ann.V + NIR +), живых (Ann.V-NIR-) и апоптотических (Ann.V + NIR-) клеток.

Анализ истощения / активации

Для оценки истощения и активации донорских клеток, мышей-реципиентов аллотрансплантировали, как и раньше (1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD3 и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM) и умерщвляли в день. 7. Лимфоциты получали из селезенки и печени и окрашивали на CD3, CD4, CD8, h3Kb, TOX и Ki67.

Анализ с течением времени

Мышей-реципиентов аллотрансплантировали, как и раньше (1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток CD8 и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM), и подвергали эвтаназии на 7-й, 14-й или 21-й день. группы.У каждой мыши брали селезенку и печень и выделяли лимфоциты. Клетки окрашивали на CXCR5, PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD4, CD8 и h3Kb.

Экстракция ДНК и ПЦР

Мышей-доноров генотипировали с использованием ПЦР на ДНК, экстрагированной из проколов ушей. В возрасте 4 недель мышам протыкали ухо и экстрагировали ДНК с использованием набора Accustart II Mouse Genotyping (95135-500 от Quanta Biosciences). Стандартные условия реакции ПЦР и последовательности праймеров от Jackson Laboratories использовали для Eomes, T-bet и CD4cre.Для Tcf7 последовательности праймеров и условия реакции были получены от доктора Джоти Мисра Сена из NIH.

РНК-секвенирование

Мышей-реципиентов аллотрансплантировали, как и раньше (1 × 10 ⁶ донорских Т-клеток и 10 × 10 ⁶ BALB / c BM), за исключением того, что донорские CD8 Т-клетки также были отсортированы с помощью FACS перед трансплантацией. . Образец отсортированных донорских клеток сохраняли для секвенирования РНК. На 7 день после трансплантации донорские Т-клетки CD8 были отсортированы с помощью FACS обратно из селезенки и печени реципиента, а для мышей, трансплантированных TCF cKO, клетки также были собраны на 14 день.Все клетки были отсортированы в тризол, затем РНК была извлечена и подготовлена ​​с помощью ядра молекулярного анализа (SUNY Upstate, https://www.upstate.edu/research/facilities/molecular-analysis.php). Парное секвенирование концов было выполнено с помощью системы Illumina NovaSeq 6000 в Университете Buffalo Genomics Core (http://ubnextgencore.buffalo.edu). Данные были предоставлены и проанализированы в Partek Flow. Данные будут депонированы (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Статистический анализ

Если в подписях к рисункам не указано иное, все числовые данные представлены как средние значения и стандартные отклонения с отдельными точками или без них.Анализ проводился в GraphPad Prism v7 или v9. Большинство данных было проанализировано с помощью t-критерия Стьюдента, одностороннего дисперсионного анализа или двустороннего дисперсионного анализа с помощью теста множественных сравнений Тьюки для методов ANOVA, в зависимости от количества групп. Анализы хи-квадрат были выполнены для гистологических степеней РТПХ. Анализ выживаемости Каплана-Мейера проводился для экспериментов на выживаемость. Все тесты были двусторонними, и значения p меньше или равные (≤) 0,05 считались значимыми. В экспериментах по пересадке использовали 3-5 мышей на группу, по крайней мере, с двумя повторами. Ex vivo эксперименты проводили два-три раза, если не указано иное, с по меньшей мере тремя повторами для каждого условия каждый раз. RNAseq выполняли один раз с тремя повторами для каждой группы и условия. qPCR проводился один раз с одним образцом на условие, и 5 мышей объединили для получения одного образца. Сортировка производилась один раз для каждого из этих двух экспериментов, и данные одного эксперимента были записаны для Supp. Рис. 3. Анализ зависимости от времени проводили один раз с 4-6 образцами на группу. Вестерн-блоттинг проводился дважды перед трансплантацией и один раз после трансплантации, каждый из которых показан по одному эксперименту.

Одобрение исследования

Все исследования на животных были рассмотрены и одобрены IACUC в SUNY Upstate Medical University. Все процедуры и эксперименты проводились в соответствии с этими утвержденными протоколами.

Прямое сравнение более безопасных или устойчивых альтернативных диполярных апротонных растворителей для использования в образовании углерод-углеродных связей

Существует большой интерес к разработке новых, более безопасных и более устойчивых полярных апротонных растворителей в связи с их важностью для промышленного применения и серьезными проблемами безопасности с наиболее часто используемыми примерами.Одна из таких областей применения — это фармацевтически релевантные реакции сочетания C – C, где полярные апротонные растворители обычно используются для обеспечения растворимости и стабилизации промежуточных продуктов реакции. Хотя в настоящее время в литературе есть несколько отличных альтернатив, на сегодняшний день они не сравнивались ни в одном исследовании. Это исследование демонстрирует эффективность зеленых растворителей N -бутилпирролидинон (NBP), γ-валеролактон (GVL), пропиленкарбонат (PC) и дигидролевоглюкозенон (Cyrene) в реакциях Хека и Бейлиса-Хиллмана.Хорошие конверсии и начальные показатели наблюдались в GVL и NBP в реакциях Хека. Кирен показал высокие начальные скорости реакции и высокие выходы в реакции Бейлиса-Хиллмана. Это демонстрирует, что Кирен является многообещающим альтернативным полярным апротонным растворителем для этой реакции.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

CORE24 GVL

Политика конфиденциальности

Дата вступления в силу: 19 ноября 2017 г.

Core 24 Gym LLC («нас», «мы» или «наш») управляет сайтом www.сайт core24gvl.com («Сервис»).

Эта страница информирует вас о нашей политике в отношении сбора, использования и раскрытия личных данных при использовании вами нашего Сервиса, а также о вариантах выбора, которые вы связали с этими данными.

Мы используем ваши данные для предоставления и улучшения Сервиса. Используя Сервис, вы соглашаетесь на сбор и использование информации в соответствии с этой политикой. Если иное не определено в настоящей Политике конфиденциальности, термины, используемые в настоящей Политике конфиденциальности, имеют то же значение, что и в наших Положениях и условиях, доступных на сайте www.core24gvl.com

Сбор и использование информации

Мы собираем несколько различных типов информации для различных целей, чтобы предоставлять вам и улучшать наш Сервис.

Типы собираемых данных

При использовании нашего Сервиса мы можем попросить вас предоставить нам определенную личную информацию, которая может быть использована для связи или идентификации вас («Личные данные»). Личная информация может включать, но не ограничивается:

• Адрес электронной почты

• Имя и фамилия

• Номер телефона

• Файлы cookie и данные об использовании

Мы также можем собирать информацию способ доступа к Сервису и его использования («Данные об использовании»).Эти данные об использовании могут включать такую ​​информацию, как адрес интернет-протокола вашего компьютера (например, IP-адрес), тип браузера, версия браузера, страницы нашего Сервиса, которые вы посещаете, время и дата вашего посещения, время, проведенное на этих страницах, уникальные идентификаторы устройств и другие диагностические данные.

Мы используем файлы cookie и аналогичные технологии отслеживания для отслеживания активности в нашем Сервисе и хранения определенной информации.

Файлы cookie — это файлы с небольшим объемом данных, которые могут включать анонимный уникальный идентификатор.Файлы cookie отправляются в ваш браузер с веб-сайта и хранятся на вашем устройстве. Также используются технологии отслеживания: маяки, теги и скрипты для сбора и отслеживания информации, а также для улучшения и анализа нашего Сервиса.

Вы можете указать своему браузеру отказаться от всех файлов cookie или указать, когда они отправляются. Однако, если вы не принимаете файлы cookie, вы не сможете использовать некоторые части нашего Сервиса.

Примеры файлов cookie, которые мы используем:

• Сессионные файлы cookie. Мы используем сеансовые файлы cookie для работы нашего Сервиса.

• Файлы cookie предпочтений. Мы используем файлы cookie предпочтений, чтобы запомнить ваши предпочтения и различные настройки.

• Файлы cookie безопасности. Мы используем файлы cookie безопасности в целях безопасности.

Использование данных

Core 24 Gym LLC использует собранные данные для различных целей:

• Для предоставления и обслуживания Услуги

• Чтобы уведомить вас об изменениях в нашей Услуге

• Чтобы вы могли для участия в интерактивных функциях нашего Сервиса, когда вы решите это сделать

• Для обеспечения обслуживания и поддержки клиентов

• Для предоставления анализа или ценной информации, чтобы мы могли улучшить Сервис

• Для мониторинга использования Служба

• Для обнаружения, предотвращения и решения технических проблем

Передача данных

Ваша информация, включая персональные данные, может передаваться и храниться на компьютерах, расположенных за пределами вашего штата, провинции, страны или другая государственная юрисдикция, где законы о защите данных могут отличаться от законов вашей юрисдикции.

Если вы находитесь за пределами США и решили предоставить нам информацию, обратите внимание, что мы передаем данные, включая Персональные данные, в Соединенные Штаты и обрабатываем их там.

Ваше согласие с настоящей Политикой конфиденциальности, за которым следует предоставление такой информации, означает ваше согласие на такую ​​передачу.

Core 24 Gym LLC примет все разумно необходимые меры для обеспечения безопасного обращения с вашими данными в соответствии с настоящей Политикой конфиденциальности, и передача ваших Персональных данных в организацию или страну не будет происходить, если не будет обеспечен надлежащий контроль. включая безопасность ваших данных и другой личной информации.

Раскрытие данных

Юридические требования

Core 24 Gym LLC может раскрывать ваши Персональные данные, добросовестно полагая, что такие действия необходимы для:

• Для выполнения юридического обязательства

• Для защиты и защиты права или собственность Core 24 Gym LLC

• Для предотвращения или расследования возможных правонарушений в связи с Сервисом

• Для защиты личной безопасности пользователей Сервиса или общественности

• Для защиты от юридической ответственности

Безопасность данных

Безопасность ваших данных важна для нас, но помните, что ни один метод передачи через Интернет или метод электронного хранения не является на 100% безопасным.Хотя мы стремимся использовать коммерчески приемлемые средства для защиты ваших Персональных данных, мы не можем гарантировать их абсолютную безопасность.

Поставщики услуг

Мы можем нанимать сторонние компании и частных лиц для содействия нашему Сервису («Поставщики услуг»), для предоставления Сервиса от нашего имени, для оказания услуг, связанных с Сервисом, или для помощи нам в анализе того, как используется наш Сервис. .

Эти третьи стороны имеют доступ к вашим Персональным данным только для выполнения этих задач от нашего имени и обязаны не раскрывать и не использовать их для каких-либо других целей.

Аналитика

Мы можем использовать сторонних поставщиков услуг для мониторинга и анализа использования нашего Сервиса.

• Google Analytics

  Google Analytics — это служба веб-аналитики, предлагаемая Google, которая отслеживает и сообщает о посещаемости веб-сайтов. Google использует собранные данные для отслеживания и контроля использования нашего Сервиса. Эти данные передаются другим сервисам Google. Google может использовать собранные данные для контекстуализации и персонализации рекламы своей собственной рекламной сети.

  Вы можете отказаться от того, чтобы ваши действия в Службе были доступны для Google Analytics, установив надстройку браузера для отказа от Google Analytics. Надстройка предотвращает передачу Google Analytics JavaScript (ga.js, analytics.js и dc.js) информации об активности посещений в Google Analytics.

  Для получения дополнительной информации о политике конфиденциальности Google посетите веб-страницу конфиденциальности и условий Google: https://policies.google.com/privacy?hl=ru

Ссылки на другие сайты

Наша служба может содержат ссылки на другие сайты, которыми мы не управляем.Если вы нажмете на ссылку третьей стороны, вы будете перенаправлены на сайт этой третьей стороны. Мы настоятельно рекомендуем вам ознакомиться с Политикой конфиденциальности каждого сайта, который вы посещаете.

Мы не контролируем и не несем ответственности за содержание, политику конфиденциальности или действия любых сторонних сайтов или служб.

Конфиденциальность детей

Наша Служба не предназначена для лиц младше 18 лет («Дети»).

Мы сознательно не собираем личную информацию от лиц младше 18 лет.Если вы являетесь родителем или опекуном и знаете, что ваши Дети предоставили нам Личные данные, свяжитесь с нами. Если нам станет известно, что мы собрали Персональные данные от детей без подтверждения согласия родителей, мы предпримем шаги для удаления этой информации с наших серверов.

Изменения в этой Политике конфиденциальности

Мы можем время от времени обновлять нашу Политику конфиденциальности. Мы сообщим вам о любых изменениях, разместив новую Политику конфиденциальности на этой странице.

Мы сообщим вам об этом по электронной почте и / или в заметном уведомлении о нашем Сервисе до того, как изменения вступят в силу, и обновим «дату вступления в силу» в верхней части настоящей Политики конфиденциальности.